1绪论 1
1.1 MCs的物化特性及其毒性 2
1.1.1 MCs的物化特性 2
1.1.2 MCs的毒性 4
1.2 MCs的提取提纯及分析测定 5
1.2.1 MCs的提取提纯研究进展 5
1.2.2 MCs的分析测定研究进展 6
1.3 MCs污染的控制 7
1.3.1 物理法 8
1.3.2 氧化降解法 9
1.3.3 生物降解法 12
2研究内容及技术路线 18
2.1 研究目标 18
2.2 研究内容 18
2.2.1 菌种筛选及其生理生化特征研究 18
2.2.2 菌株的分子生物学鉴定 18
2.2.3 菌株降解MC-RR特性 18
2.2.4 基因USTB-05-A的克隆 19
2.2.5 基因USTB-05-A的表达 19
2.2.6 菌株降解MC-RR的第一步分子途径及机理 19
2.3 技术路线 20
3降解MC-RR菌株的筛选与生理生化特征 21
3.1 实验材料与仪器设备 21
3.1.1 蓝藻藻样 21
3.1.2 菌种来源 21
3.1.3 微生物培养基及培养条件 21
3.1.4 药品与试剂 21
3.1.5 主要仪器 22
3.2 实验方法 22
3.2.1 MC-RR的分析测定 22
3.2.2 MC-RR提取提纯 23
3.2.3 菌种筛选 23
3.2.4 菌株细胞形态观察 24
3.2.5 菌株生长曲线的绘制 25
3.2.6 菌株耐盐性研究 25
3.2.7 菌株耐酸碱性研究 25
3.2.8 菌株抗生素抗性研究 25
3.3 MC-RR的提取提纯结果 25
3.4 菌种筛选结果 26
3.4.1 混合菌种筛选 26
3.4.2 纯菌种筛选 27
3.5 菌落形态观察及革兰氏染色 28
3.6 USTB-05的生长曲线 28
3.7 菌株USTB-05的耐盐性 29
3.8 菌株USTB-05的耐酸碱性 29
3.9 USTB-05对抗生素的抗性 29
3.10 本章小结 29
4菌株USTB-05的分子生物学鉴定 31
4.1 实验材料 31
4.1.1 菌株和质粒 31
4.1.2 培养基 31
4.1.3 PCR引物 32
4.1.4 药品与试剂 32
4.1.5 常用的生物信息分析的相关软件及网站 32
4.1.6 主要仪器 32
4.2 实验方法 33
4.2.1 USTB-05基因组DNA的提取 33
4.2.2 PCR反应体系及步骤 34
4.2.3 琼脂糖凝胶电泳 35
4.2.4 目的基因的回收 35
4.2.5 目的基因与pGEM-T Easy载体连接 36
4.2.6 连接产物转化DH5α感受态细胞 36
4.2.7 质粒的提取 36
4.2.8 阳性克隆鉴定与测序 37
4.2.9 16S rDNA序列分析与菌属鉴定 38
4.3 USTB-05基因组DNA的提取结果 38
4.4 16S rDNA的PCR扩增结果 39
4.5 16S rDNA片段序列分析结果 39
4.5.1 去载体 39
4.5.2 BLAST搜索 40
4.6 系统发育树的绘制 42
4.7 本章小结 43
5 USTB-05对MC-RR的降解特性研究 44
5.1 实验材料 44
5.1.1 菌种与试剂 44
5.1.2 主要仪器 44
5.2 实验方法 45
5.2.1 溶解氧对USTB-05降解MC-RR的效应 45
5.2.2 温度对USTB-05降解MC-RR的影响 45
5.2.3 pH值对USTB-05降解MC-RR的影响 45
5.2.4 USTB-05菌株对MC-RR的降解 46
5.2.5 USTB-05菌株无细胞提取液（CE）制备 46
5.2.6 CE对MC-RR的降解 46
5.3 溶解氧的效应 47
5.4 温度的影响结果 47
5.5 初始pH值的影响结果 48
5.6 不同培养条件下USTB-05的生长情况 49
5.7 USTB-05菌株对MC-RR的降解 49
5.8 无细胞提取液对MC-RR的降解 50
5.9 本章小结 54
6基因USTB-05-A的克隆 55
6.1 实验材料 55
6.1.1 菌种 55
6.1.2 药品及试剂 55
6.1.3 主要溶液 56
6.1.4 主要仪器 56
6.2 实验方法 56
6.2.1 PCR获取USTB-05降解基因簇片段 56
6.2.2 DNA凝胶电泳 57
6.2.3 目的片段回收 57
6.2.4 目的片段与T载体连接 58
6.2.5 连接产物转化DH5α感受态细胞 58
6.2.6 质粒提取 58
6.2.7 阳性克隆鉴定及测序 58
6.2.8 反向PCR获取USTB-05未知序列 58
6.2.9 高保真PCR获取USTB-05菌完整降解基因 60
6.2.10 设计基因USTB-05-A克隆引物 62
6.2.11 PCR扩增、连接T载体、转化及鉴定 63
6.2.12 pGEX-4T-1载体获得 64
6.2.13 目的基因与pGEX-4T-1载体制备 64
6.2.14 重组质粒pGEX-USTB-05-A/BL21 （DE3）构建 65
6.2.15 阳性克隆鉴定及测序 65
6.3 降解MC-RR基因初步探索 65
6.4 反向PCR扩增未知序列 67
6.4.1 反向PCR扩增结果 67
6.4.2 序列分析拼接 67
6.5 高保真PCR获取USTB-05菌降解MC-RR完整基因 69
6.5.1 高保真PCR 69
6.5.2 序列拼接 69
6.5.3 获取开放阅读框（ORF） 69
6.6 PCR扩增USTB-05-A基因 70
6.7 克隆重组质粒转化大肠杆菌的阳性鉴定 70
6.8 T Easy/ USTB-05-A测序结果 71
6.9 USTB-05-A基因与pGEX-4T-1载体双酶切 73
6.10 表达重组质粒转化大肠杆菌的阳性鉴定 74
6.11 本章小结 74
7基因USTB-05-A的表达 76
7.1 实验材料 76
7.1.1 菌种及主要药剂 76
7.1.2 主要溶液 76
7.1.3 主要仪器 76
7.2 实验方法 78
7.2.1 SDS-PAGE检测蛋白质表达 78
7.2.2 USTB-05-A基因工程菌总蛋白提取及浓度测定 79
7.2.3 影响诱导表达单因素条件试验 79
7.2.4 最佳条件下的重组蛋白诱导表达 80
7.2.5 重组蛋白酶包涵体鉴定 81
7.2.6 重组蛋白酶的分离纯化 81
7.2.7 表达蛋白酶的活性验证 82
7.2.8 基因工程菌与USTB-05菌体降解MC-RR活性对比 82
7.3 影响表达量的单因素影响结果 83
7.4 最佳条件下重组蛋白酶诱导表达 84
7.5 包涵体验证结果 85
7.6 表达蛋白降解MC-RR活性验证 85
7.7 重组蛋白酶初步分离 89
7.8 USTB-05菌体与基因工程菌降解MC-RR活性对比 89
7.9 本章小结 95
8 USTB-05催化降解MC-RR第一步机理 96
8.1 实验材料 96
8.1.1 主要溶液 96
8.1.2 主要仪器 96
8.2 实验方法 98
8.2.1 重组蛋白酶对MC-RR的降解 98
8.2.2 MC-RR第一个降解产物质谱分析 98
8.3 重组蛋白酶对MC-RR的降解结果 99
8.4 MC-RR第一个降解产物质谱分析 102
8.5 USTB-05降解MC-RR第一步途径推测 103
8.6 本章小结 105
9结论与展望 106
9.1 主要结论 106
9.2 主要创新点 107
9.3 展望 107
参考文献 108
附录 USTB-05-A基因与mlrA基因序列 118