典型微囊藻毒素微生物降解技术及原理PDF电子书下载

1绪论 1

1.1 MCs的物化特性及其毒性 2

1.1.1 MCs的物化特性 2

1.1.2 MCs的毒性 4

1.2 MCs的提取提纯及分析测定 5

1.2.1 MCs的提取提纯研究进展 5

1.2.2 MCs的分析测定研究进展 6

1.3 MCs污染的控制 7

1.3.1 物理法 8

1.3.2 氧化降解法 9

1.3.3 生物降解法 12

2研究内容及技术路线 18

2.1 研究目标 18

2.2 研究内容 18

2.2.1 菌种筛选及其生理生化特征研究 18

2.2.2 菌株的分子生物学鉴定 18

2.2.3 菌株降解MC-RR特性 18

2.2.4 基因USTB-05-A的克隆 19

2.2.5 基因USTB-05-A的表达 19

2.2.6 菌株降解MC-RR的第一步分子途径及机理 19

2.3 技术路线 20

3降解MC-RR菌株的筛选与生理生化特征 21

3.1 实验材料与仪器设备 21

3.1.1 蓝藻藻样 21

3.1.2 菌种来源 21

3.1.3 微生物培养基及培养条件 21

3.1.4 药品与试剂 21

3.1.5 主要仪器 22

3.2 实验方法 22

3.2.1 MC-RR的分析测定 22

3.2.2 MC-RR提取提纯 23

3.2.3 菌种筛选 23

3.2.4 菌株细胞形态观察 24

3.2.5 菌株生长曲线的绘制 25

3.2.6 菌株耐盐性研究 25

3.2.7 菌株耐酸碱性研究 25

3.2.8 菌株抗生素抗性研究 25

3.3 MC-RR的提取提纯结果 25

3.4 菌种筛选结果 26

3.4.1 混合菌种筛选 26

3.4.2 纯菌种筛选 27

3.5 菌落形态观察及革兰氏染色 28

3.6 USTB-05的生长曲线 28

3.7 菌株USTB-05的耐盐性 29

3.8 菌株USTB-05的耐酸碱性 29

3.9 USTB-05对抗生素的抗性 29

3.10 本章小结 29

4菌株USTB-05的分子生物学鉴定 31

4.1 实验材料 31

4.1.1 菌株和质粒 31

4.1.2 培养基 31

4.1.3 PCR引物 32

4.1.4 药品与试剂 32

4.1.5 常用的生物信息分析的相关软件及网站 32

4.1.6 主要仪器 32

4.2 实验方法 33

4.2.1 USTB-05基因组DNA的提取 33

4.2.2 PCR反应体系及步骤 34

4.2.3 琼脂糖凝胶电泳 35

4.2.4 目的基因的回收 35

4.2.5 目的基因与pGEM-T Easy载体连接 36

4.2.6 连接产物转化DH5α感受态细胞 36

4.2.7 质粒的提取 36

4.2.8 阳性克隆鉴定与测序 37

4.2.9 16S rDNA序列分析与菌属鉴定 38

4.3 USTB-05基因组DNA的提取结果 38

4.4 16S rDNA的PCR扩增结果 39

4.5 16S rDNA片段序列分析结果 39

4.5.1 去载体 39

4.5.2 BLAST搜索 40

4.6 系统发育树的绘制 42

4.7 本章小结 43

5 USTB-05对MC-RR的降解特性研究 44

5.1 实验材料 44

5.1.1 菌种与试剂 44

5.1.2 主要仪器 44

5.2 实验方法 45

5.2.1 溶解氧对USTB-05降解MC-RR的效应 45

5.2.2 温度对USTB-05降解MC-RR的影响 45

5.2.3 pH值对USTB-05降解MC-RR的影响 45

5.2.4 USTB-05菌株对MC-RR的降解 46

5.2.5 USTB-05菌株无细胞提取液（CE）制备 46

5.2.6 CE对MC-RR的降解 46

5.3 溶解氧的效应 47

5.4 温度的影响结果 47

5.5 初始pH值的影响结果 48

5.6 不同培养条件下USTB-05的生长情况 49

5.7 USTB-05菌株对MC-RR的降解 49

5.8 无细胞提取液对MC-RR的降解 50

5.9 本章小结 54

6基因USTB-05-A的克隆 55

6.1 实验材料 55

6.1.1 菌种 55

6.1.2 药品及试剂 55

6.1.3 主要溶液 56

6.1.4 主要仪器 56

6.2 实验方法 56

6.2.1 PCR获取USTB-05降解基因簇片段 56

6.2.2 DNA凝胶电泳 57

6.2.3 目的片段回收 57

6.2.4 目的片段与T载体连接 58

6.2.5 连接产物转化DH5α感受态细胞 58

6.2.6 质粒提取 58

6.2.7 阳性克隆鉴定及测序 58

6.2.8 反向PCR获取USTB-05未知序列 58

6.2.9 高保真PCR获取USTB-05菌完整降解基因 60

6.2.10 设计基因USTB-05-A克隆引物 62

6.2.11 PCR扩增、连接T载体、转化及鉴定 63

6.2.12 pGEX-4T-1载体获得 64

6.2.13 目的基因与pGEX-4T-1载体制备 64

6.2.14 重组质粒pGEX-USTB-05-A/BL21 （DE3）构建 65

6.2.15 阳性克隆鉴定及测序 65

6.3 降解MC-RR基因初步探索 65

6.4 反向PCR扩增未知序列 67

6.4.1 反向PCR扩增结果 67

6.4.2 序列分析拼接 67

6.5 高保真PCR获取USTB-05菌降解MC-RR完整基因 69

6.5.1 高保真PCR 69

6.5.2 序列拼接 69

6.5.3 获取开放阅读框（ORF） 69

6.6 PCR扩增USTB-05-A基因 70

6.7 克隆重组质粒转化大肠杆菌的阳性鉴定 70

6.8 T Easy/ USTB-05-A测序结果 71

6.9 USTB-05-A基因与pGEX-4T-1载体双酶切 73

6.10 表达重组质粒转化大肠杆菌的阳性鉴定 74

6.11 本章小结 74

7基因USTB-05-A的表达 76

7.1 实验材料 76

7.1.1 菌种及主要药剂 76

7.1.2 主要溶液 76

7.1.3 主要仪器 76

7.2 实验方法 78

7.2.1 SDS-PAGE检测蛋白质表达 78

7.2.2 USTB-05-A基因工程菌总蛋白提取及浓度测定 79

7.2.3 影响诱导表达单因素条件试验 79

7.2.4 最佳条件下的重组蛋白诱导表达 80

7.2.5 重组蛋白酶包涵体鉴定 81

7.2.6 重组蛋白酶的分离纯化 81

7.2.7 表达蛋白酶的活性验证 82

7.2.8 基因工程菌与USTB-05菌体降解MC-RR活性对比 82

7.3 影响表达量的单因素影响结果 83

7.4 最佳条件下重组蛋白酶诱导表达 84

7.5 包涵体验证结果 85

7.6 表达蛋白降解MC-RR活性验证 85

7.7 重组蛋白酶初步分离 89

7.8 USTB-05菌体与基因工程菌降解MC-RR活性对比 89

7.9 本章小结 95

8 USTB-05催化降解MC-RR第一步机理 96

8.1 实验材料 96

8.1.1 主要溶液 96

8.1.2 主要仪器 96

8.2 实验方法 98

8.2.1 重组蛋白酶对MC-RR的降解 98

8.2.2 MC-RR第一个降解产物质谱分析 98

8.3 重组蛋白酶对MC-RR的降解结果 99

8.4 MC-RR第一个降解产物质谱分析 102

8.5 USTB-05降解MC-RR第一步途径推测 103

8.6 本章小结 105

9结论与展望 106

9.1 主要结论 106

9.2 主要创新点 107

9.3 展望 107

参考文献 108

附录 USTB-05-A基因与mlrA基因序列 118