1重温RNA和细胞生物化学 1
为什么研究RNA？ 1
RNA是什么？ 2
多核苷酸的装配 5
RNA的种类 8
转录和中心法则 10
研究转录的重要动植物模型 11
启动子和调控元件 12
基因和基因组的组织影响转录 14
RNA聚合酶和转录产物 18
信使RNA 22
典型的mRNA分子的拓扑学 23
5＇帽 23
引导序列 25
编码区 25
尾随序列 26
多聚A尾 26
细胞器mRNA 28
mRNA的稳定性、转运和转归 29
双顺反子mRNA 30
原核mRNA 30
mRNA的序列和结构影响翻译 31
基因调控的水平 32
来自单基因座的mRNA的可变剪接 34
反式剪接：mRNA的修复 35
小RNA综观 36
微小RNA对基因表达的调控 37
参考文献 38
2分离RNA的策略 45
概述 45
纯化RNA过程中的目标 47
裂解缓冲液配方 49
温和的裂解缓冲液 49
方案：用低渗裂解分离胞质RNA 51
离液性裂解缓冲液 56
用含胍的缓冲液分离RNA 57
胍-酸-酚抽提技术 58
方案：胍-酸-酚抽提 59
密度梯度离心 60
氯化铯 61
方案：氯化铯梯度 61
三氟乙酸铯 65
方案：三氟乙酸铯梯度 65
同时分离RNA和DNA 68
方案：同时分离RNA和DNA 69
说说试剂盒 71
硅胶的技术 72
用硅胶柱分离胞质RNA 73
亲和介质 73
其他方法 74
方案：用十二烷基硫酸钠和乙酸钾试剂快速分离RNA 74
方案：分离原核RNA 75
方案：分离酵母RNA 76
提纯的RNA的短期和长期保存 78
参考文献 79
3关于组织的真相 81
概述 81
组织培养物还是组织？ 81
细胞培养的优点 82
组织样品的优点 83
匀浆法 84
用Polytron捣碎 84
用Dounce匀浆器匀浆 86
BeadBeaterTM技术 87
各种器官和组织的RNA分离的策略 87
新鲜组织 89
冻存组织 90
固定的组织 91
方案：分离组织RNA的LiCl-尿素法 92
方案：从富含类脂样品分离RNA 95
与聚核糖体结合的mRNA的提纯 96
方案：聚核糖体mRNA的分离 98
在野外收集样品 99
RNA“清洗”法 100
从组织分离RNA的困难解决 101
参考文献 102
4走向绿色：植物RNA及其分子生物学 105
概述 105
RNA的分离和植物的怪异点 105
植物细胞产生的RNA的种类 109
方案：从叶中分离RNA 110
方案：从树皮中分离RNA 112
方案：从果实中分离RNA 113
从其他植物组织分离RNA的策略 115
从植物组织分离RNA的困难解决 116
参考文献和建议阅读 117
5带PolyA尾的RNA的分离 121
概述 121
加PolyA尾 122
利用Poly （A）时的注意事项 123
例1 124
例2 124
选择带PolyA尾的分子 126
用于提纯Poly （A）+的磁珠技术 127
Oligo （dT）-纤维素柱层析 129
方案：大量Poly （A）+RNA的提纯 130
不用柱的快速Poly （A）+提纯 135
方案：不用柱的Poly （A）+提纯 135
参考文献 136
6 RNA制品的质量控制 139
概述 139
质控技术1：紫外分光光度法和光吸收比 140
分光光度法 140
核酸浓度的测定 141
核酸纯度的测定 143
非分光光度法 145
质控技术2：RNA的电泳图 147
方案 149
质控技术3：紫外光投影 150
方案 151
质控技术4：样品支持RT-PCR的能力 152
质控技术5：Northern分析 153
质控技术6：样品支持体外翻译的能力 153
参考文献 154
7棘手的核糖核酸酶 155
概述 155
核糖核酸酶活力的去除 156
潜伏的RNase污染问题 157
核糖核酸酶抑制剂的种类 158
专一抑制剂 158
氧钒核糖核苷络合物 158
RNasin？ 159
非专一抑制剂 160
仪器和试剂的准备 161
焦碳酸二乙酯 162
代替剂：灭菌水 164
过氧化氢 164
氢氧化钠和十二烷基硫酸钠 165
控制核酸酶活力用的其他试剂 165
盐酸胍 165
硫氰酸胍 165
十二烷基硫酸钠 166
N-十二烷基肌氨酸 166
酚：氯仿：异戊醇 166
8-羟基喹啉 167
氯化铯 167
三氟乙酸铯 168
蛋白酶K 168
“RNAlater”（商品名） 169
方案：氧钒核糖核苷络合物的合成 169
参考文献 170
8严谨度：影响核酸结构的条件 173
双链分子的种类 173
控制严谨度的重要性 174
盐对严谨度的影响 176
pH对严谨度的影响 176
温度对严谨度的影响 177
甲酰胺对严谨度的影响 177
尿素对严谨度的影响 177
参考文献 178
9 RNA电泳 179
概述 179
核酸的标准化 180
方案：Poly （A）的标准化 183
样品制备 183
琼脂糖凝胶电泳的RNA变性系统 185
甲醛变性 187
方案：甲醛变性胶 188
尿素变性 189
方案：尿素变性 191
乙二醛、二甲基亚砜变性 191
方案：RNA的乙二醛化和电泳 192
用非变性胶跑RNA电泳 194
分子量标准 194
分子大小标准的恰当应用 195
核糖体RNA 197
凝胶染色技术 204
溴乙锭 204
SYBR绿 207
SYBR金 207
安全SYBR 208
“GelStar”染色剂 209
银染色 209
吖啶橙 210
亚甲基蓝 210
安全考虑和仪器维护 212
第一次跑琼脂糖电泳：一些提示 213
基本词汇表 213
要牢记的几点 213
参考文献 216
10照相记录和影像分析 221
概述 221
安全第一 222
数字影像分析 223
影像格式 228
实际的考虑 229
适用于任何预算的数字影像分析 231
影像分析学习班 232
磷屏显像仪 232
传统的照相记录方法 233
样品显影 234
滤光 234
将电泳图谱最优化的几点提示 235
照相底片和X光片的内在局限性 238
参考文献和建议阅读 239
11 Northern分析 241
概述 241
滤膜的选择 242
硝酸纤维素膜 243
尼龙膜 244
聚偏二氟乙烯膜 245
处理和滤膜准备 245
Northern转移技术 246
毛细现像转移 246
“TurboBlotter”转移器 247
负压转移 248
电转移 249
碱性转移 249
方案：利用被动的毛细扩散转移RNA 250
方案：用TurboBlotter向下转移RNA 252
滤膜转移后的处理 254
甲醛变性系统 254
乙二醛变性系统 254
选择1 254
选择2 255
固定化技术 255
烘烤 255
紫外光交联 256
方案：用紫外光把RNA交联在尼龙膜上 257
滤膜固定后的处理 257
逆Northern分析 258
参考文献 259
12核酸探针技术 261
概述 261
探针的分类 263
选择标记系统 263
同位素标记 265
尽可能避免分解问题 266
非同位素标记 267
通用染料Cy3和Cy5 267
常用的化学发光方式 268
生物素 268
洋地黄苷原 270
荧光素 271
直接酶标记 271
DNA探针 272
DNA探针的合成 273
聚合酶链式反应 274
随机引物反应 274
缺口转移 274
5＇末端标记 275
3＇末端标记 275
反义RNA探针 276
RNA探针的特征 278
RNA探针的合成 278
体外转录 278
5＇末端标记 279
3＇末端标记 279
探针的纯化 279
探针的保存 280
参考文献 281
13核酸杂交的实践 283
概述 283
影响杂交动力学和双链稳定性的因素 284
温度 285
离子强度 286
pH 287
探针长度 287
探针浓度 287
G+C含量 288
错配 288
探针复杂度 289
粘度 289
甲酰胺 290
尿素 290
杂交温度 291
长探针的熔点温度 291
寡核苷酸探针的熔点温度 292
杂交和Northern分析 292
预杂交：滤膜的准备 293
方案：长探针预杂交 293
探针变性 294
杂交 295
杂交后的严谨度洗涤 295
除去探针和重杂交 296
方案：除去探针的通用方法 297
参考文献 298
14检出的原理 301
概述 301
放射自显影 302
滤膜的处理 304
X光片 305
安全灯 306
曝光时间 306
增感屏 307
荧光显影 308
胶片预闪光 309
片匣的种类 309
显影和定影 310
方案：放射自显影 310
非同位素方法 312
生物素 313
洋地黄苷原 313
荧光显影 314
直接酶标 314
用化学发光检出 314
化学发光的底物 315
显色检出方法 317
数字影像系统 318
参考文献 320
15用抗核酸酶技术定量特定的mRNA 321
概述 321
基本方法 322
探针的选择 327
最优化建议 329
潜在困难 330
方案：用S1核酸酶分析定量转录物 332
方案：用抗核糖核酸酶检验定量转录物 335
困难解决 337
参考文献 338
16核RNA的分析 341
概述 341
转录速率的检验 343
与稳态RNA研究的关系 346
核Run-off与核Run-on检验 347
方案：核Run-off检验 348
细胞的收获和细胞核的制备 349
制备易破细胞核的另一方法 349
从整块组织制备细胞核的另一方法 350
转录物的标记和回收 351
靶DNA的制备 353
杂交用RNA的制备 354
杂交后的洗涤和检出 355
方案：核Run-off检验的另一方法 356
方案：抗核酸酶检验-脉冲标记转录检验 357
区分各种RNA聚合酶的活力 359
提取核RNA用于稳态分析 360
方案：直接分离核RNA 361
方案：从富含核糖核酸酶的细胞中制备核RNA 362
核RNA分析的困难解决 363
参考文献 364
17 cDNA合成 367
概述 367
cDNA合成——概论 368
合成第一链的考虑 369
逆转录酶的选择 372
合成第二链的考虑 375
经典方法 376
基于PCR的方法 377
方案：第一链cDNA合成 377
评估cDNA合成的效率 379
克隆cDNA 379
连接的考虑 381
用于连接的酶 383
应用 383
参考文献 384
18逆转录PCR：一种科学和技术形式 385
概述 385
PCR——概论 386
逆转录PCR一般研究 391
PCR样品间沾染的防止 395
实验室的设计 395
程序方法 396
阻挡气溶胶的窍门 397
尿嘧啶-N-糖苷酶 398
引物设计 398
基本规则 402
Tm的考虑 406
估计Tm 406
Tm的精确计算 407
网上资源 407
多重引物的设计 407
最优化手续 408
热稳定聚合酶 411
正对照 413
负对照 413
热启动PCR 413
锁定的核酸 415
降落PCR 416
内对照 416
关于转录调控 419
PC R产物的分析 420
逆转录PCR质量控制的注意点 421
验证来自PCR的数据的非PCR方法 423
相关技术 424
5＇ RACE PCR 424
5＇ RLM-RACE 426
3＇ RACE-PCR 426
巢式PCR 428
长距离PCR 429
单细胞PCR 431
发夹式接头PCR 433
猎取可变转录起始位点 434
方案：第一链cDNA合成 435
方案：cDNA的PCR扩增 436
克隆PCR产物 437
方案：把平头PCR产物加A尾 438
方案：TA克隆的连接反应 438
“拓扑”克隆 440
其他扩增方法 441
RNA的线性扩增（Eberwine过程） 441
链替换扩增 442
基于核酸序列的扩增（NASBA） 443
连接酶链式反应 443
参考文献 443
19定量PCR技术 449
概述 449
灵敏度指数 450
定量研究 451
实时PCR 453
实时PCR平台 456
SYBR绿检验 457
TaqMan？检验 458
分子信标 458
“LUX”牌引物 460
“蝎子”引物 461
熔点曲线分析 462
内对照 463
外对照 463
对照反应的设置方式 467
负对照的考虑 471
竞争PCR：关键的考虑 472
竞争PCR：所包括的主要步骤 477
另一方法：非实时竞争PCR 479
方案：竞争PCR 480
非同源竞争物的合成 480
第1链cDNA的合成 481
竞争PCR（一级扩增） 482
竞争PCR（二级扩增） 484
影像分析的考虑 485
定量PCR技术的困难解决 486
参考文献 488
20功能基因组学和转录物总体分析 491
概述 491
功能基因组学的定义 491
功能基因组学研究方法的重要性 492
常用的功能基因组学研究方法 493
功能基因组学和经典分子生物学 496
21基因表达的高通量分析 499
概述 499
什么是微阵列？ 500
什么是热图？ 502
微阵列能做什么？ 504
微阵列不能做什么？ 504
微阵列分析的主要步骤 507
参考RNA 509
宏阵列是什么？ 510
应用 512
参考文献 512
22整体分析基因表达的非阵列方法 515
概述 515
基本问题 516
消减方法 517
抑制性消减杂交（SSH） 517
困难解决 524
非消减方法 526
mRNA差别显示 526
各种方案 529
参考文献 536
23 RNA干扰：Dicer酶在RISC复合物中起作用 539
概述 539
RNAi的基本名词 541
RNA干扰——它如何工作 542
siRNA方法 545
shRNA方法 546
将siRNA导入哺乳动物细胞的方法 548
miRNA 549
siRNA的有效设计 550
RNAi和转录物可变剪切 552
体外和体内问题 553
RNAi的确认 555
RT-PCR方法 556
Northern杂交分析 556
Western杂交分析 556
应用 557
参考文献 557
24基因组、转录组、蛋白质组和生物信息学 561
概述 561
基本名词 563
基因组和基因组学 564
转录组和转录组学 565
蛋白质组和蛋白质组学 566
生物信息学 571
搜索基因——BLAST一下！ 571
参考文献 573
25 RNA一例 575
一个典型实验？ 577
灵敏度问题 580
下一步做什么 580
到哪儿去求助 582
尾声 585
几粒智慧之珠 585
附录A保留完整准确的记录 591
附录B把质量转换为摩尔 593
附录C对分子生物学家有用的储存液 597
附录D酚的制备 603
附录E溴乙锭和SYBR绿溶液的弃去 607
附录F用DNase Ⅰ从RNA样品中除去DNA 611
附录G用RNase保温从DNA样品中除去RNA 613
附录H甲酰胺、甲醛和乙二醛的去离子 615
附录I硅化离心管和玻璃器具 617
附录J贴壁细胞的胰酶处理方案 619
附录K盐析法分离高分子量DNA 621
附录L电泳：原理、参数和安全 625
附录M聚丙烯酰胺凝胶电泳 637
附录N点杂交分析 641
附录O离心是分子生物学家的主流工具 649
附录P仪器和试剂供应商及服务商选登 655
附录Q有用的国际单位制单位 663
附录R常用缩写 665
附录S商标摘录 667
术语表 671
索引 693