第一章 显微技术 1
第一节 显微观察 1
一、相差显微镜 1
实验1-1相差显微镜的使用 1
二、荧光显微镜 3
实验1-2荧光显微镜的使用 5
三、电子显微镜 7
实验1-3细菌、酵母菌超薄切片的透射电镜观察 8
实验1-4噬菌体的透射电镜观察 10
实验1-5质粒DNA的透射电镜观察 10
实验1-6酵母细胞的扫描电镜观察 13
第二节 显微摄影 14
实验1-7显微摄影、菌落摄影和凝胶摄影 15
第三节 放射自显影 18
实验1-8硝酸纤维素滤纸上标记DNA的放射自显影 18
第四节 显微操作技术用于单细胞分离 19
实验1-9显微操纵器用于单细胞分离 20
实验1-10显微操纵器用于酵母子囊的解剖及子囊孢子单孢化 21
实验1-11玻璃微型工具的制作 22
第五节 流式细胞仪测定细胞核内DNA的含量 23
实验1-12流式细胞仪计数法 24
第二章 微生物细胞特殊结构的观察 25
第一节 染色技术 25
一、染色的基本原理 25
二、染料 25
三、染色 26
实验2-1真菌的荧光染色与观察 26
第二节 细胞主要结构成分的分离与观察 28
实验2-2革兰阳性细菌细胞壁的制备 29
实验2-3酵母细胞壁甘露聚糖的制备 30
实验2-4细胞壁的形态观察 31
实验2-5革兰阴性菌细胞外膜蛋白的分离 32
实验2-6细菌荚膜的观察 33
实验2-7细菌鞭毛的观察 33
实验2-8微生物细胞核的观察 35
实验2-9细菌染色体DNA的分离与观察 36
实验2-10异染颗粒的观察 37
实验2-11酵母细胞内脂肪颗粒和肝糖颗粒的观察 38
实验2-12酵母液泡及线粒体的提取 39
第三节 芽孢、子囊孢子和假菌丝的观察 42
一、芽孢 42
实验2-13细菌芽孢形成及发芽的观察 44
实验2-14伴孢晶体的观察 44
二、酵母子囊孢子 45
实验2-15酵母子囊孢子的形成及观察 45
实验2-16酿酒酵母单倍体细胞的制备与鉴定 46
三、流式细胞术 47
实验2-17酿酒酵母染色体倍性鉴定 48
四、酵母假菌丝 48
实验2-18酵母假菌丝的观察 49
第三章 噬菌体 50
实验3-1噬菌体的分离与纯化 52
实验3-2高效价噬菌体原液的制备 53
实验3-3溶源菌的鉴定 54
实验3-4抗噬菌体产α-淀粉酶菌株的选育 55
第四章 标记菌种的获得与应用 56
第一节 富集培养技术在获得标记菌种中的应用 56
一、营养缺陷型富集法在原核细胞中的应用 56
实验4-1芽孢杆菌营养缺陷型的筛选 56
二、营养缺陷型富集法在真核细胞中的应用 58
实验4-2酵母营养缺陷型的筛选 59
实验4-3青霉菌营养缺陷型菌株的筛选 59
三、浓度梯度法富集抗性突变株 60
四、富集法在研究次级代谢的重组DNA技术中的应用 61
第二节 营养缺陷型标记菌种的获得 62
一、诱变方法 62
二、淘汰野生型 62
三、检出缺陷型 62
四、营养缺陷型生长谱的确定 63
实验4-4芽孢杆菌营养缺陷型生长谱的确定 65
第三节 呼吸缺陷型标记菌种的获得 66
实验4-5酵母呼吸缺陷型的筛选 67
第四节 抗反馈调节抗性突变株的获得与应用 67
实验4-6氨基酸抗反馈调节突变株的选育 69
第五章 原生质体系列育种技术 71
第一节 工业菌种育种的策略 71
第二节 原生质体融合育种 72
一、原生质体融合育种的特点 72
二、原生质体融合育种步骤与要点 74
三、原生质体再生率和融合率的计算 77
实验5-1芽孢杆菌的原生质体融合 77
实验5-2链霉菌原生质体融合 78
实验5-3小单胞菌的原生质体融合 80
实验5-4酿酒酵母的原生质体融合 81
实验5-5丝状真菌的原生质体融合 82
第三节 原生质体转化育种 85
实验5-6芽孢杆菌原生质体转化 86
实验5-7质粒DNA转化链霉菌原生质体 86
实验5-8酿酒酵母的原生质体转化法 87
实验5-9真菌原生质体转化 88
第四节 原生质体诱变育种 90
实验5-10芽孢杆菌种间融合子F-26-2原生质体诱变育种 90
实验5-11紫外线诱变原生质体选育L谷氨酸高产菌 90
第五节 原生质体技术中的一些特殊技术 92
一、紫外线照射原生质体增加融合率 92
二、供体原生质体的热灭活 92
三、原生质体电融合技术 93
实验5-12电诱导酵母原生质体融合 93
四、遗传转移 93
实验5-13原生质体融合法转移酵母线粒体及杀伤质粒 94
第六章 基因工程育种技术 96
第一节 基因工程的基本过程和原理 96
一、载体 96
二、DNA重组用酶 98
第二节 大肠杆菌基因工程 102
一、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 102
实验6-1用氯化钙制备和转化感受态大肠杆菌 103
实验6-2用氯化钙制备感受态大肠杆菌 104
实验6-3用PEG制备和转化大肠杆菌感受态细胞 104
实验6-4大肠杆菌的电击转化 105
二、大肠杆菌中质粒的提取与纯化 106
实验6-5质粒的大量提取与纯化 106
实验6-6质粒的小量提取 107
实验6-7用硅胶膜分离法小量提取质粒 108
三、外源基因在大肠杆菌中的高表达 109
实验6-8载体和基因的酶切 111
实验6-9基因与载体的连接 112
第三节 非大肠杆菌微生物基因工程 115
一、芽孢杆菌基因工程 115
实验6-10枯草杆菌感受态细胞的制备和转化 117
实验6-11枯草杆菌染色体DNA的提取 117
实验6-12枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）碱性果胶酶基因的PCR扩增 118
实验6-13从电泳凝胶中分离枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）碱性果胶酶基因 119
实验6-14枯草杆菌转化子质粒的提取和检测 119
实验6-15地衣芽孢杆菌感受态细胞的诱导形成及其高效电转化 120
二、酵母基因工程 121
实验6-16酵母染色体DNA的提取 122
实验6-17酿酒酵母的乙酸锂完整细胞转化法 123
实验6-18单链载体DNA的制备 124
实验6-19酵母菌质粒DNA的提取 124
实验6-20碱性果胶酶基因重组巴斯德毕赤酵母的构建 125
实验6-21羟酸还原异构酶基因多拷贝重组啤酒酵母的构建 129
第四节 其他基因工程育种常用技术 130
实验6-22酿酒酵母W303甘油酯酶GPP2基因敲除技术 130
实验6-23粗糙脉孢菌漆酶基因的定点突变技术 131
第五节 蛋白质纯化技术 133
实验6-24利用His标签进行Ni柱纯化甘油脱氢酶的分离技术 133
实验6-25离子交换色谱技术分离纯化蛋白质 135
第七章 微生物细胞固定化方法 137
第一节 载体结合法 137
一、表面吸附法 138
二、共价结合法 138
实验7-1 Amycolatopsis sp.ST2710的载体固定化 138
第二节 交联法 139
第三节 包埋法 140
一、藻酸钙凝胶包埋法 140
实验7-2酿酒酵母的藻酸钙固定化 141
实验7-3固定化枯草杆菌连续生产耐热α-淀粉酶 143
二、к-角叉胶包埋法 143
实验7-4к-角叉胶一步包埋法 144
实验7-5к-角叉胶二步包埋法 145
实验7-6固定化酵母连续生产酒精 146
实验7-7固定化细胞的回收与活细胞计数 146
三、聚丙烯酰胺凝胶包埋法 147
实验7-8大肠杆菌的聚丙烯酰胺凝胶固定化 147
四、光交联树脂前聚体包埋法 148
实验7-9光交联树脂固定化原生质体 148
第八章 菌种保藏方法与机构 149
第一节 菌种的退化与防治措施 149
一、菌种退化的现象及原因 149
二、防止退化措施 150
第二节 常用菌种保藏 151
一、菌种保藏的原理 151
二、常用的菌种保藏方法 151
实验8-1斜面保藏法 151
实验8-2液体石蜡保藏法 152
实验8-3载体保藏法 152
实验8-4甘油管低温保藏法 154
实验8-5液氮冷冻保藏法 154
实验8-6真空冷冻干燥保藏法 156
第三节 基因工程菌的保藏 157
第四节 著名菌种保藏及专利菌种保藏机构 158
一、中国微生物菌种保藏管理委员会组织系统 158
二、国际著名菌种保藏机构 159
三、国际确认的专利菌种保藏机构（IDA） 167
参考文献 169