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第一章 显微技术 1

第一节 显微观察 1

一、相差显微镜 1

实验1-1相差显微镜的使用 1

二、荧光显微镜 3

实验1-2荧光显微镜的使用 5

三、电子显微镜 7

实验1-3细菌、酵母菌超薄切片的透射电镜观察 8

实验1-4噬菌体的透射电镜观察 10

实验1-5质粒DNA的透射电镜观察 10

实验1-6酵母细胞的扫描电镜观察 13

第二节 显微摄影 14

实验1-7显微摄影、菌落摄影和凝胶摄影 15

第三节 放射自显影 18

实验1-8硝酸纤维素滤纸上标记DNA的放射自显影 18

第四节 显微操作技术用于单细胞分离 19

实验1-9显微操纵器用于单细胞分离 20

实验1-10显微操纵器用于酵母子囊的解剖及子囊孢子单孢化 21

实验1-11玻璃微型工具的制作 22

第五节 流式细胞仪测定细胞核内DNA的含量 23

实验1-12流式细胞仪计数法 24

第二章 微生物细胞特殊结构的观察 25

第一节 染色技术 25

一、染色的基本原理 25

二、染料 25

三、染色 26

实验2-1真菌的荧光染色与观察 26

第二节 细胞主要结构成分的分离与观察 28

实验2-2革兰阳性细菌细胞壁的制备 29

实验2-3酵母细胞壁甘露聚糖的制备 30

实验2-4细胞壁的形态观察 31

实验2-5革兰阴性菌细胞外膜蛋白的分离 32

实验2-6细菌荚膜的观察 33

实验2-7细菌鞭毛的观察 33

实验2-8微生物细胞核的观察 35

实验2-9细菌染色体DNA的分离与观察 36

实验2-10异染颗粒的观察 37

实验2-11酵母细胞内脂肪颗粒和肝糖颗粒的观察 38

实验2-12酵母液泡及线粒体的提取 39

第三节 芽孢、子囊孢子和假菌丝的观察 42

一、芽孢 42

实验2-13细菌芽孢形成及发芽的观察 44

实验2-14伴孢晶体的观察 44

二、酵母子囊孢子 45

实验2-15酵母子囊孢子的形成及观察 45

实验2-16酿酒酵母单倍体细胞的制备与鉴定 46

三、流式细胞术 47

实验2-17酿酒酵母染色体倍性鉴定 48

四、酵母假菌丝 48

实验2-18酵母假菌丝的观察 49

第三章 噬菌体 50

实验3-1噬菌体的分离与纯化 52

实验3-2高效价噬菌体原液的制备 53

实验3-3溶源菌的鉴定 54

实验3-4抗噬菌体产α-淀粉酶菌株的选育 55

第四章 标记菌种的获得与应用 56

第一节 富集培养技术在获得标记菌种中的应用 56

一、营养缺陷型富集法在原核细胞中的应用 56

实验4-1芽孢杆菌营养缺陷型的筛选 56

二、营养缺陷型富集法在真核细胞中的应用 58

实验4-2酵母营养缺陷型的筛选 59

实验4-3青霉菌营养缺陷型菌株的筛选 59

三、浓度梯度法富集抗性突变株 60

四、富集法在研究次级代谢的重组DNA技术中的应用 61

第二节 营养缺陷型标记菌种的获得 62

一、诱变方法 62

二、淘汰野生型 62

三、检出缺陷型 62

四、营养缺陷型生长谱的确定 63

实验4-4芽孢杆菌营养缺陷型生长谱的确定 65

第三节 呼吸缺陷型标记菌种的获得 66

实验4-5酵母呼吸缺陷型的筛选 67

第四节 抗反馈调节抗性突变株的获得与应用 67

实验4-6氨基酸抗反馈调节突变株的选育 69

第五章 原生质体系列育种技术 71

第一节 工业菌种育种的策略 71

第二节 原生质体融合育种 72

一、原生质体融合育种的特点 72

二、原生质体融合育种步骤与要点 74

三、原生质体再生率和融合率的计算 77

实验5-1芽孢杆菌的原生质体融合 77

实验5-2链霉菌原生质体融合 78

实验5-3小单胞菌的原生质体融合 80

实验5-4酿酒酵母的原生质体融合 81

实验5-5丝状真菌的原生质体融合 82

第三节 原生质体转化育种 85

实验5-6芽孢杆菌原生质体转化 86

实验5-7质粒DNA转化链霉菌原生质体 86

实验5-8酿酒酵母的原生质体转化法 87

实验5-9真菌原生质体转化 88

第四节 原生质体诱变育种 90

实验5-10芽孢杆菌种间融合子F-26-2原生质体诱变育种 90

实验5-11紫外线诱变原生质体选育L谷氨酸高产菌 90

第五节 原生质体技术中的一些特殊技术 92

一、紫外线照射原生质体增加融合率 92

二、供体原生质体的热灭活 92

三、原生质体电融合技术 93

实验5-12电诱导酵母原生质体融合 93

四、遗传转移 93

实验5-13原生质体融合法转移酵母线粒体及杀伤质粒 94

第六章 基因工程育种技术 96

第一节 基因工程的基本过程和原理 96

一、载体 96

二、DNA重组用酶 98

第二节 大肠杆菌基因工程 102

一、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 102

实验6-1用氯化钙制备和转化感受态大肠杆菌 103

实验6-2用氯化钙制备感受态大肠杆菌 104

实验6-3用PEG制备和转化大肠杆菌感受态细胞 104

实验6-4大肠杆菌的电击转化 105

二、大肠杆菌中质粒的提取与纯化 106

实验6-5质粒的大量提取与纯化 106

实验6-6质粒的小量提取 107

实验6-7用硅胶膜分离法小量提取质粒 108

三、外源基因在大肠杆菌中的高表达 109

实验6-8载体和基因的酶切 111

实验6-9基因与载体的连接 112

第三节 非大肠杆菌微生物基因工程 115

一、芽孢杆菌基因工程 115

实验6-10枯草杆菌感受态细胞的制备和转化 117

实验6-11枯草杆菌染色体DNA的提取 117

实验6-12枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）碱性果胶酶基因的PCR扩增 118

实验6-13从电泳凝胶中分离枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）碱性果胶酶基因 119

实验6-14枯草杆菌转化子质粒的提取和检测 119

实验6-15地衣芽孢杆菌感受态细胞的诱导形成及其高效电转化 120

二、酵母基因工程 121

实验6-16酵母染色体DNA的提取 122

实验6-17酿酒酵母的乙酸锂完整细胞转化法 123

实验6-18单链载体DNA的制备 124

实验6-19酵母菌质粒DNA的提取 124

实验6-20碱性果胶酶基因重组巴斯德毕赤酵母的构建 125

实验6-21羟酸还原异构酶基因多拷贝重组啤酒酵母的构建 129

第四节 其他基因工程育种常用技术 130

实验6-22酿酒酵母W303甘油酯酶GPP2基因敲除技术 130

实验6-23粗糙脉孢菌漆酶基因的定点突变技术 131

第五节 蛋白质纯化技术 133

实验6-24利用His标签进行Ni柱纯化甘油脱氢酶的分离技术 133

实验6-25离子交换色谱技术分离纯化蛋白质 135

第七章 微生物细胞固定化方法 137

第一节 载体结合法 137

一、表面吸附法 138

二、共价结合法 138

实验7-1 Amycolatopsis sp.ST2710的载体固定化 138

第二节 交联法 139

第三节 包埋法 140

一、藻酸钙凝胶包埋法 140

实验7-2酿酒酵母的藻酸钙固定化 141

实验7-3固定化枯草杆菌连续生产耐热α-淀粉酶 143

二、к-角叉胶包埋法 143

实验7-4к-角叉胶一步包埋法 144

实验7-5к-角叉胶二步包埋法 145

实验7-6固定化酵母连续生产酒精 146

实验7-7固定化细胞的回收与活细胞计数 146

三、聚丙烯酰胺凝胶包埋法 147

实验7-8大肠杆菌的聚丙烯酰胺凝胶固定化 147

四、光交联树脂前聚体包埋法 148

实验7-9光交联树脂固定化原生质体 148

第八章 菌种保藏方法与机构 149

第一节 菌种的退化与防治措施 149

一、菌种退化的现象及原因 149

二、防止退化措施 150

第二节 常用菌种保藏 151

一、菌种保藏的原理 151

二、常用的菌种保藏方法 151

实验8-1斜面保藏法 151

实验8-2液体石蜡保藏法 152

实验8-3载体保藏法 152

实验8-4甘油管低温保藏法 154

实验8-5液氮冷冻保藏法 154

实验8-6真空冷冻干燥保藏法 156

第三节 基因工程菌的保藏 157

第四节 著名菌种保藏及专利菌种保藏机构 158

一、中国微生物菌种保藏管理委员会组织系统 158

二、国际著名菌种保藏机构 159

三、国际确认的专利菌种保藏机构（IDA） 167

参考文献 169