第一篇 概述 1
第一章 概况 3
1.1 转基因农作物发展概况 3
1.2 我国进口转基因农产品概况 3
1.3 我国进出境转基因产品检测体系建设 4
1.3.1 我国进出境转基因产品检测技术体系建设 4
1.3.2 我国进出境转基因产品检测标准体系建设 6
1.3.3 我国进出境转基因产品检测实验室体系建设 7
1.4 农产品转基因成分检测靶标分析 7
1.5 农产品转基因成分检测技术路线 11
第二章 农产品转基因成分检测技术 12
2.1 概况 12
2.2 基于核酸的检测技术 12
2.2.1 PCR 12
2.2.2 实时荧光PCR 13
2.2.3 PCR-DHPLC检测 13
2.2.4 基因芯片检测 14
2.2.5 生物传感器技术 14
2.3 基于外源蛋白的检测技术 15
第二篇 农产品转基因成分PCR-DHPLC检测 17
第三章 农产品转基因成分PCR-DHPLC引物设计 19
3.1 引物设计原理 19
3.2 设计的引物序列 19
第四章 农产品转基因成分单重PCR-DHPLC检测 23
4.1 材料、试剂与仪器 23
4.1.1 供试材料 23
4.1.2 实验试剂 24
4.1.3 引物序列 24
4.1.4 主要仪器设备 26
4.2 方法 26
4.2.1 DNA提取 26
4.2.2 PCR扩增 26
4.2.3 DHPLC检测 26
4.3 结果与分析 27
4.3.1 内源基因检测 27
4.3.2 筛查检测 28
4.3.3 外源功能基因检测 30
4.3.4 转基因品系检测 33
4.4 结论 49
第五章 农产品转基因成分多重PCR-DHPLC检测 50
5.1 材料、试剂与仪器 50
5.1.1 供试材料 50
5.1.2 实验试剂 50
5.1.3 引物序列 50
5.1.4 主要仪器设备 50
5.2 方法 50
5.2.1 DNA提取 50
5.2.2 PCR扩增 50
5.2.3 DHPLC检测 51
5.2.4 多重PCR-DHPLC特异性测定 51
5.2.5 多重PCR-DHPLC灵敏度测定 51
5.3 结果与分析 51
5.3.1 转基因大豆检测 51
5.3.2 转基因棉花检测 52
5.3.3 转基因玉米检测 55
5.3.4 转基因小麦检测 56
5.3.5 转基因油菜检测 57
5.4 结论 59
第六章 农产品转基因成分PCR-DHPLC试剂盒研制 60
6.1 转基因大豆DHPLC检测试剂盒研制 60
6.1.1 引物 60
6.1.2 反应体系 60
6.1.3 反应条件 61
6.1.4 试剂盒使用说明 61
6.2 转基因棉花DHPLC检测试剂盒研制 62
6.2.1 引物 62
6.2.2 反应体系 62
6.2.3 反应条件 63
6.2.4 试剂盒使用说明 63
6.3 转基因玉米DHPLC检测试剂盒研制 64
6.3.1 引物 65
6.3.2 反应体系 65
6.3.3 反应条件 65
6.3.4 试剂盒使用说明 65
6.4 转基因水稻DHPLC检测试剂盒研制 67
6.4.1 引物 67
6.4.2 反应体系 67
6.4.3 反应条件 67
6.4.4 试剂盒使用说明 67
6.5 转基因小麦DHPLC检测试剂盒研制 68
6.5.1 引物 68
6.5.2 反应体系的建立 69
6.5.3 反应条件 69
6.5.4 试剂盒使用说明 69
第三篇 农产品转基因成分可视芯片检测技术 71
第七章 农产品转基因成分可视芯片检测引物与探针设计 73
7.1 引物与探针设计原则 73
7.2 引物与探针设计方法 73
7.2.1 引物设计 73
7.2.2 探针设计 76
7.3 引物与探针设计结果 76
第八章 农产品转基因样品核酸制备 79
8.1 材料、试剂与仪器 79
8.1.1 供试材料 79
8.1.2 实验试剂 79
8.1.3 主要仪器设备 79
8.2 方法 79
8.2.1 样品保存 79
8.2.2 CTAB法提取微量转基因样品DNA 79
8.2.3 DNA浓度及纯度检测 80
8.2.4 内源基因扩增验证 80
8.3 结果与分析 80
8.3.1 基因组DNA提取 80
8.3.2 内源基因扩增验证 80
8.4 讨论 81
8.4.1 基因组DNA提取 81
8.4.2 内源基因扩增验证 82
第九章 引物、探针验证及光学薄膜生物传感器技术优化 83
9.1 材料、试剂与仪器 83
9.1.1 供试材料 83
9.1.2 实验试剂 83
9.1.3 主要仪器设备及耗材 83
9.2 方法 83
9.2.1 引物与探针保存 83
9.2.2 PCR扩增 84
9.2.3 点制探针芯片 84
9.2.4 基本步骤 84
9.2.5 技术优化 84
9.2.6 引物及探针有效性及特异性验证 84
9.3 结果 85
9.3.1 光学薄膜生物传感器芯片技术优化 85
9.3.2 引物与探针有效性及特异性验证 85
9.4 讨论 86
第十章 农产品转基因成分可视芯片—膜芯片检测技术 88
10.1 材料、试剂与仪器 88
10.1.1 材料 88
10.1.2 主要仪器设备 88
10.2 方法 88
10.2.1 转基因玉米品系或结构特异性检测 88
10.2.2 转基因木瓜、水稻、大豆外源DNA成分检测 88
10.2.3 转基因棉花及油菜八重PCR—可视芯片检测 90
10.3 结果与分析 90
10.3.1 转基因玉米PCR-光学薄膜生物传感器芯片检测 90
10.3.2 转基因木瓜、水稻、大豆外源DNA成分检测 92
10.3.3 转基因棉花及油菜八重PCR—光学薄膜生物传感器芯片检测 94
10.4 结论 95
第十一章 农产品转基因成分可视芯片-微孔板芯片检测技术 96
11.1 材料、试剂与仪器 96
11.1.1 供试材料 96
11.1.2 试剂 97
11.1.3 引物探针 97
11.1.4 主要仪器设备 99
11.2 方法 99
11.2.1 DNA提取 99
11.2.2 DNA浓度的测定 99
11.2.3 PCR扩增 99
11.2.4 芯片探针制备 100
11.2.5 杂交反应 100
11.3 结果与分析 100
11.3.1 特异性 100
11.3.2 灵敏度 101
11.4 结论 102
第十二章 转基因作物可视芯片检测试剂盒研制 104
12.1 DNA提取及纯度、浓度测定 104
12.2 引物探针设计 104
12.3 反应体系及条件 104
12.4 试剂盒说明 104
12.4.1 试剂盒组成 104
12.4.2 引物信息 105
12.4.3 检测芯片信息 105
12.5 使用方法 106
12.5.1 实验准备 106
12.5.2 实验步骤 106
12.5.3 结果判定 106
第四篇 农产品转基因成分固相芯片检测及定性定量PCR检测 109
第十三章 转基因大豆多重滚环扩增-基因芯片检测 111
13.1 材料 111
13.1.1 供试材料 111
13.1.2 主要试剂及仪器设备 111
13.2 方法 111
13.2.1 锁式探针设计 111
13.2.2 固相芯片点样 111
13.2.3 固相芯片点样及预处理 112
13.3 结果 112
第十四章 检疫性真菌、病毒和转基因成分多重滚环扩增-基因芯片检测 114
14.1 材料 114
14.1.1 供试真菌菌株 114
14.1.2 供试病毒毒株 117
14.2 方法 118
14.2.1 固相芯片点样 118
14.2.2 多重特异性测试 118
14.3 实验结果 119
第十五章 转基因水果常规PCR检测方法 120
15.1 材料、试剂与仪器 120
15.1.1 供试材料 120
15.1.2 实验试剂 120
15.1.3 主要仪器设备 121
15.2 方法 121
15.2.1 植物基因组DNA的提取 121
15.2.2 PCR检测 121
15.2.3 PCR产物片段克隆 122
15.3 结果与分析 123
15.3.1 DNA提取 123
15.3.2 插入外源基因表达结构 123
15.3.3 基因特异性PCR 124
15.3.4 基因特异性多重PCR 129
15.4 结论 130
第十六章 转基因水果实时荧光PCR检测方法 131
16.1 材料、试剂与仪器 131
16.1.1 供试材料 131
16.1.2 实验试剂 131
16.1.3 主要仪器设备 131
16.2 方法 131
16.2.1 引物探针 131
16.2.2 扩增 132
16.3 结果与分析 133
16.3.1 检测灵敏度 133
16.3.2 实时荧光PCR 134
16.3.3 双重荧光PCR检测转基因木瓜 140
16.4 结论 140
第十七章 转基因油菜品系检测 141
17.1 材料、试剂与仪器 141
17.1.1 供试材料 141
17.1.2 实验试剂 142
17.1.3 主要仪器设备 142
17.2 方法 142
17.2.1 参试样DNA提取、纯化和测定 142
17.2.2 DNA纯化 143
17.2.3 DNA浓度和纯度测定 143
17.2.4 引物设计 143
17.2.5 单重PCR检测体系和条件的建立 144
17.2.6 PCR产物鉴定 144
17.2.7 多重PCR检测体系和条件筛选 144
17.2.8 特异性检测 145
17.2.9 多重PCR灵敏度检测 145
17.2.10 重复性实验 145
17.3 结果与分析 145
17.3.1 单重PCR退火温度优化 145
17.3.2 PCR产物测序 145
17.3.3 多重PCR优化 147
17.3.4 单重PCR特异性 147
17.3.5 多重PCR特异性 150
17.3.6 多重PCR灵敏度 151
17.3.7 多重PCR的重复性检测 151
17.4 讨论 152
17.4.1 多重PCR检测的实用性 152
17.4.2 多重PCR结合其他检测技术在转基因检测中的运用 152
第十八章 转基因饲料检测方法研究 153
18.1 材料、试剂与仪器 153
18.1.1 供试材料 153
18.1.2 试剂 154
18.1.3 主要仪器设备 154
18.2 方法 154
18.2.1 DNA的抽提及浓度测定 154
18.2.2 定量PCR检测 155
18.2.3 PCR产物的凝胶电泳检测 157
18.2.4 Southern blot检测 157
18.2.5 DNA测序法 158
18.3 结果与分析 158
18.3.1 核酸制备 158
18.3.2 定量PCR 159
18.3.3 定性PCR扩增 165
18.3.4 Southern blot 168
18.3.5 测序 168
18.4 讨论与结论 169
18.4.1 讨论 169
18.4.2 结论 169
第十九章 转基因玉米和油菜品系数字PCR定量方法研究 171
19.1 前言 171
19.2 材料与方法 171
19.2.1 材料 171
19.2.2 实验方法 171
19.3 结果与分析 173
19.3.1 转基因玉米和油菜品系扩增稳定性结果 173
19.3.2 转基因玉米和油菜品系特异性扩增结果 182
19.3.3 转基因玉米和油菜品系的线性范围测定结果 189
19.3.4 转基因玉米和油菜品系的定量检测限和检测限结果 196
19.3.5 转基因玉米和油菜品系的精密度试验测定结果 200
19.4 结论 202
第五篇 农产品转基因成分溯源技术研究 205
第二十章 出口产品转基因成分溯源平台开发 207
20.1 RFID技术 207
20.2 基于RFID的出口产品转基因成分溯源系统构成 207
20.2.1 硬件构成 207
20.2.2 软件构成 208
20.3 结论 210
第二十一章 出口大米及米制品非转基因溯源技术测试 211
21.1 前言 211
21.2 硬件 211
21.3 测试方法 212
21.4 测试结果 214
21.5 结论 215
第二十二章 出口产品转基因成分溯源技术体系全程溯源示范 216
22.1 示范企业基地建设 216
22.1.1 江西某食品有限公司场地调查 216
22.1.2 某米业有限公司场地调查 216
22.1.3 硬件设备安装测试 216
22.1.4 软件安装调试 218
22.1.5 硬件软件培训 219
22.1.6 转基因管理制度建设 219
22.2 企业现场示范研究 220
22.2.1 江西某米粉厂现场示范研究 220
22.2.2 某米业有限公司现场示范研究 221
第六篇 农产品转基因成分检测计量与标准 223
第二十三章 转基因检测质粒阳性参考物质研制 225
23.1 材料、试剂与仪器 225
23.1.1 供试材料 225
23.1.2 实验试剂 226
23.1.3 引物序列 226
23.1.4 主要仪器设备 226
23.2 实验方法 226
23.2.1 DNA提取 226
23.2.2 PCR扩增 227
23.2.3 电泳 227
23.2.4 PCR产物纯化 227
23.2.5 连接T载体 227
23.2.6 转化感受态细胞 227
23.2.7 菌落PCR鉴定 227
23.2.8 提取质粒 228
23.2.9 克隆测序 228
23.2.10 序列分析 228
23.3 结果与分析 228
23.3.1 大豆相关克隆 228
23.3.2 棉花相关克隆 228
23.3.3 玉米相关克隆 229
23.3.4 水稻相关克隆 232
23.3.5 小麦相关克隆 233
23.4 结论 240
第二十四章 植物转基因产品检测计量标准资源整合与共享调查 241
24.1 调查方法 241
24.1.1 调查对象 241
24.1.2 调查时间 241
24.1.3 调查方式 241
24.1.4 调查内容 241
24.1.5 调查步骤 241
24.1.6 质量控制 242
24.1.7 数据处理和分析方法 242
24.2 结果 242
24.2.1 转基因产品检测计量标准资源 242
24.2.2 信息库的建设 243
24.2.3 实物库建设 243
24.3 讨论 243
第二十五章 转基因成分测量计量标准资源分类技术规范 244
25.1 前言 244
25.2 范围 244
25.3 引用文献 244
25.4 定义 244
25.5 转基因成分测量计量标准资源应符合的条件 246
25.6 转基因成分测量计量标准资源的分类 246
25.6.1 转基因成分测量参考标准资源 246
25.6.2 转基因成分测量参考方法资源 247
25.6.3 转基因成分检定规程资源 247
25.6.4 转基因成分检测技术规范资源 247
25.6.5 转基因产品管理和检测的政策法规 247
25.6.6 转基因成分检测的比对信息资源 247
25.6.7 转基因产品检测参考实验室资源 248
25.6.8 转基因成分检测人才信息资源 248
第二十六章 国内外转基因产品检测标准发展概况 249
26.1 转基因产品检测国际标准 249
26.2 转基因产品检测国外标准 250
26.3 转基因产品检测国家标准 252
26.4 转基因产品检测行业标准 253
26.4.1 国家质检总局进出境转基因产品检测行业标准 253
26.4.2 我国农业部门颁布的转基因产品检测行业标准 255
26.4.3 我国林业部门转基因产品检测行业标准 262
26.4.4 我国环保部门转基因产品检测行业标准 262
26.4.5 我国烟草部门转基因产品检测行业标准 263
26.5 结论与讨论 263
附录 研究所形成的标准 277
附录1 转基因产品检测 基因芯片检测方法 279
附录2 转基因玉米品系检测 可视芯片检测方法 295
附录3 植物性饲料中转基因成分PCR检测方法 300
附录4 转基因大豆DHPLC检测方法 308
附录5 转基因棉花DHPLC检测方法 312
附录6 转基因大米PCR-DHPLC检测方法 316
附录7 转基因玉米检测微滴式数字PCR定量方法 321
附录8 转基因植物产品的数字PCR检测方法玉米98140品系 326
附录9 转基因植物产品的数字PCR检测方法玉米DAS40278-9品系 331
附录10 转基因植物产品的数字PCR检测方法玉米VCO-01981-5品系 336
附录11 转基因植物产品的数字PCR检测方法玉米MON87427品系 341
附录12 转基因植物产品的数字PCR检测方法油菜73496品系 346
附录13 转基因植物产品的数字PCR检测方法油菜RF2品系 351
附录14 转基因植物产品的数字PCR检测方法油菜Topas19/2品系 356
附录15 转基因植物产品的数字PCR检测方法油菜T45品系 361
附录16 转基因植物产品的数字PCR检测方法油菜MON88302品系 366
附录17 转基因植物产品的数字PCR检测方法油菜OXY235品系 371
参考文献 376