实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术PDF电子书下载

第一章 总论 1

第一节 有关的免疫学理论 2

一、抗原、抗体的概念及抗原抗体的关系 2

(一)抗原 2

(二)抗体 2

(三)抗原与抗体的关系 2

二、抗原的性质及种类 2

(一)抗原的性质 2

(二)抗原的种类 3

三、抗体的性质和种类 4

(一)抗体的一般性质 4

(二)抗原性和分类特征 4

(四)抗原与抗体的反应 5

(三)抗体的种类 5

四、抗体形成的机理 6

(一)免疫反应的形成 6

(二)影响抗体产生的因素 6

五、补体系统 7

第二节 免疫细胞化学的有关技术概述 8

一、抗体的制备和配制 8

(一)抗体的制备 8

(二)抗体的配制 8

二、组织材料的处理 10

三、免疫染色 10

五、免疫细胞化学结果的判断 11

(二)阴性对照 11

(一)阳性对照 11

四、对照 11

(一)阳性细胞的染色特征 12

(二)染色失败的几种原因 12

第三节 有关细胞和组织学技术 12

一、细胞和组织 12

(一)细胞标本的取材 13

(二)组织标本的取材 13

二、细胞和组织的固定 14

(一)固定 14

(二)固定剂 14

(三)固定方法 16

三、组织切片技术 16

第一节 抗原的制备 21

第二章 抗原与抗体的制备 21

一、抗原的提取 22

(一)材料的选择及预处理 22

(二)细胞的粉碎 22

(三)抗原的提取 23

(四)抗原的分离与纯化 25

(五)抗原的浓缩 32

二、免疫原的制备 34

(一)载体 34

(二)偶联剂 34

(三)制备过程 35

(三)佐剂 36

(二)免疫途径 36

第二节 抗体的制备 36

(一)用于免疫的动物 36

一、抗血清的制备 36

(四)免疫方法 37

(五)抗血清的采集与保存 37

(六)抗血清质量的评价 37

(七)免疫失败的可能原因及应采取的措施 39

二、单克隆抗体的制备 39

(一)动物的选择与免疫 40

(二)细胞融合 41

(四)杂交瘤的克隆化 43

(三)选择杂交瘤细胞及抗体检测 43

(五)杂交瘤细胞的冻存与复苏 44

(六)单克隆抗体的大量生产 45

(七)单克隆抗体的鉴定 45

第三节 抗体的提取与纯化 46

一、盐析法 46

二、冷酒精沉淀法 47

三、DEAE-Sephadex A-50柱层析纯化免疫球蛋白 47

(一)操作步骤 47

(二)注意事项 48

(三)试剂器材 49

(二)操作步骤 49

(四)注意事项 49

四、SPA-Sepharose CL-4B亲合层析纯化IgG及IgG亚类 49

(一)原理 49

五、高效液相色谱纯化小鼠腹水中单克隆抗体 50

(一)原理 50

(二)操作步骤 50

(三)试剂和器材 50

(四)注意事项 50

第三章 免疫荧光细胞化学技术 52

第一节 免疫荧光细胞化学的原理 52

一、直接法 53

二、间接法 53

四、双重免疫荧光标记法 54

五、对照试验 54

三、补体法 54

第二节 荧光抗体的制备 55

一、荧光素 55

(一)异硫氰酸荧光素(FITC) 55

(二)四乙基罗达明(RB200) 56

(三)四甲基异硫氰酸罗达明(TMRITC) 56

二、荧光素标记抗体的方法 56

(一)FITC标记抗体的方法 56

(二)四乙基罗达明标记抗体方法 58

(三)四甲基异硫氰酸罗达明标记抗体方法 58

(四)藻红蛋白标记抗体方法 59

(五)PE-标记蛋白A方法 59

(六)蓝色荧光素标记抗体方法 59

(一)染色特异性和敏感性的测定 60

(二)F／P比值的测定 60

三、荧光抗体的质量控制 60

四、荧光抗体的保存 61

第三节 免疫荧光细胞化学染色方法 61

一、标本制作 61

二、荧光抗体染色方法 61

(一)直接法 61

(二)间接法 61

(三)补体法 62

一、荧光显微镜 63

第四节 荧光显微镜检查法 63

三、荧光抗原染色法 63

(六)荧光抗体再染色法 63

(五)双重染色法 63

(四)膜抗原荧光抗体染色法 63

(一)光源 64

(二)滤色系统 64

(三)反光镜 66

(四)聚光镜 66

(五)物镜 66

(六)目镜 66

(七)落射光装置 66

三、使用荧光显微镜的注意事项 67

(五)镜油 67

(三)标本 67

(四)封裱剂 67

(一)载玻片 67

二、荧光显微镜标本制作要求 67

(二)盖玻片 67

四、荧光图像的记录方法 68

第五节 非特异性染色的消除方法 68

一、非特异性染色的主要因素 68

二、消除非特异性染色的方法 68

(一)动物脏器粉末吸收法 68

(二)透析法 69

(三)葡聚糖凝胶G-50柱层析法 69

(六)纯化抗原法 70

(八)伊文氏蓝(Evans blue)衬染法 70

(七)纯化抗体法--免疫吸收法 70

(五)荧光抗体稀释法 70

(四)DEAE纤维素柱层析法 70

第四章 免疫酶细胞化学 72

第一节 固定和切片 72

一、固定 72

二、切片 73

第二节 染色方法 74

一、酶标抗体法 74

(一)酶的种类及特点 74

(二)酶标抗体的制备 75

(三)酶标抗体的纯化 78

(四)染色原理及步骤 78

二、非标记抗体酶法 81

(一)酶桥法 81

(二)PAP法 82

第三节 结果分析 86

一、对照实验 87

二、假阳性及其处理 87

三、抗体有关事项 88

四、单克隆抗体 89

五、增加染色强度方法 90

第四节 ICC的几种特殊应用 91

一、ICC在铺片中的应用 91

二、ICC的双重染色法 92

(一)切片 93

(二)染色 93

三、ICC在细胞功能研究中的应用 94

四、ICC在原位杂交技术中的应用 95

第五章 免疫金银及铁标记技术 98

第一节 免疫金技术发展史 98

第二节 溶胶的基本概念 98

一、胶体金 98

(一)离子分散体系 98

(二)胶体分散体系 98

(三)粗分散体系 99

二、胶体金的一般性状 99

(一)胶体金的颜色 99

(二)胶体金的稳定性 99

(三)溶胶的聚沉现象 99

(二)试剂的配制要求 100

(一)玻璃器皿的清洁 100

第三节 胶体金的制备方法 100

一、制备胶体金的准备 100

二、制备胶体金的方法和步骤 101

(一)白磷还原法 101

(二)抗坏血酸还原法 101

(三)柠檬酸三钠还原法 102

(四)鞣酸-柠檬酸三钠还原法 102

(五)乙醇超声波还原法 103

(六)硼氢化钠还原法 103

(七)放射性胶体金的制备方法 103

第四节 胶体金的质量鉴定 103

一、胶体金颗粒直径测定 103

二、胶体金金颗粒均匀度测定 103

一、待标记蛋白质的准备 104

二、胶体金pH值的调整 104

三、影响胶体金颗粒大小的因素 104

第五节 胶体金标记物的制备 104

三、待标记蛋白质最适稳定量的测定 105

四、蛋白质的胶体金标记 106

五、胶体金标记蛋白质的纯化 107

(一)高速与超速离心法 107

(二)凝胶过滤法 108

六、免疫金探针的鉴定 108

第六节 免疫胶体金银细胞化学染色的固定剂选择 109

一、固定剂的选择及固定时间 109

二、切片的处理与粘附 109

(二)蛋白A-金(PAG)放大法 110

(一)免疫金法(IGS) 110

第七节 光镜免疫金银细胞化学方法 110

一、免疫金染色 110

二、免疫金银法 111

(一)石蜡切片的IGSS染色 112

(二)冰冻切片的IGSS染色 112

(三)半薄切片的IGSS染色 113

三、彩色免疫金银法(CIGSS) 113

四、免疫金及免疫金银技术的优点 114

五、在IGSS染色中常见技术问题和对策 115

(一)背景染色产生的原因 115

(二)背景染色已发生应如何消除 115

(一)缓冲液的配制 116

(二)银显影液的配制 116

(三)彩色显影背景过染的处理方法 116

六、物理显影液及缓冲液的配制 116

(三)柠檬酸缓冲液的配制 117

(四)氢氧化钠(NaOH)无水乙醇饱和溶液的配制 117

第八节 免疫胶体铁细胞化学 117

一、胶体铁的制备方法 117

二、抗体的标记和纯化 118

三、胶体铁标记抗体的鉴定 118

四、免疫胶体铁细胞化学染色 118

五、方法的应用 119

一、基本原理 121

二、几种抗生物素-生物素染色法 121

第一节 抗生物素-生物素免疫细胞化学染色法 121

第六章 亲合组织化学技术及免疫细胞化学技术的某些进展 121

第二节 葡萄球菌蛋白A(SPA) 124

一、SPA的性质 124

二、SPA的应用 125

三、SPA在免疫细胞化学染色中的应用 126

第三节 凝集素 127

一、凝集素的特征 128

二、凝集素的应用 128

三、凝集素在免疫细胞化学中的应用 129

四、HRP标记凝集素及抗凝集素抗体的制备 131

第四节 免疫细胞化学技术的某些新进展 132

二、免疫染色 135

一、组织固定与取材 135

第一节 电子显微镜免疫细胞化学技术概述 135

第七章 电子显微镜免疫细胞化学技术 135

二、包埋 136

(一)树脂包埋 136

(二)低温包埋 136

四、对照试验 140

第二节 免疫铁蛋白技术 140

一、基本原理 140

二、铁蛋白的提取和纯化 140

三、铁蛋白与免疫球蛋白的结合 141

四、电镜标本的制备方法 142

第三节 免疫酶细胞化学技术 142

一、基本原理 142

二、电镜标本的制备方法 143

一、电镜水平的免疫金染色法 144

第四节 免疫电镜胶体金标记法 144

二、胶体金标记蛋白A技术 146

三、胶体金双标记技术 147

四、免疫电镜金-银法染色技术 148

第五节 其它免疫电镜技术 149

一、凝集素电镜标记技术 149

二、扫描免疫电镜技术 149

(一)标记物 150

(二)免疫标记方法 150

(三)扫描免疫电镜的具体操作步骤 150

三、冷冻蚀刻免疫电镜技术 152

(一)RIA的优点 155

(二)RIA的缺点 155

第一节 概述 155

一、放射免疫分析的优缺点 155

第八章 蛋白质与多肽激素的放射免疫分析 155

二、基本原理 156

第二节 放射性碘标记 158

一、同位素的选择 158

二、蛋白质与多肽激素的放射性碘标记 159

(一)氯胺T法 159

(二)乳过氧化物酶法 162

(三)Iodogen碘化法 163

(四)酰化试剂(Bloton和Hunter试剂)法 163

(一)纯化标记化合物的常用方法 164

(二)标记化合物的主要质量指标 164

三、放射性标记化合物的纯化与鉴定 164

第三节 结合和游离部分的分离 169

一、对分离方法的要求 169

二、常用的分离方法 169

(一)吸附分离法 170

(二)沉淀分离法 170

(二)双抗体分离法 170

(四)磁性分离法 170

(五)固相包被分离法 171

(六)双抗法？PEG的分离法 171

第四节 样品的前处理 171

一、脑、脊髓与垂体中神经肽的提取(以大鼠为例) 171

四、血浆 172

三、内脏、肿瘤组织中神经肽的提取(以胃粘膜为例) 172

二、大鼠脑神经核团微穿孔取样方法(以下丘脑为例) 172

五、脑脊液 174

六、尿 174

七、胃液 174

第五节 放射免疫分析法的建立 174

一、放射免疫分析的基本试剂 174

(一)标准品 174

(二)标记物 175

(三)抗体 175

(四)B与F分离剂 175

(五)缓冲液 175

二、加样程序 175

(二)顺序饱和加样程序 176

(一)平衡饱和加样程序 176

(三)计数、绘制标准曲线与测定样品含量 177

三、放射免疫分析的质量控制 177

(一)质量控制的目的和内容 177

(二)放射免疫分析中造成测量误差的因素 178

(三)放射免疫分析中测量误差的控制 178

第九章 免疫细胞化学与图像分析 180

一、定量分析的重要性 180

二、图像分析仪简介 180

三、常用的测量方法 182

(一)灰度 182

(二)长度 183

(三)面积 183

四、图像分析仪工作程序 183

五、没有图像分析仪可否进行图像分析 185

六、实例介绍 188

七、图像分析与体视学 189

八、国内外生产图像分析仪的情况简介 191

(一)国内情况 191

(二)国外情况 191

第十章 流式细胞术(FCM)在免疫细胞化学中的应用 194

第一节 流式细胞术简介 194

一、流式细胞术发展简史 194

二、流式细胞计的基本结构和工作原理 195

第二节 FCM在生物医学工程学方面的应用 202

一、FCM应用的技术途径 202

二、FCM的典型应用简介 203

一、白细胞的免疫荧光标记技术 207

第三节 FCM对外周血白细胞的免疫荧光分析 207

二、白细胞免疫荧光分析的数据分析 210

三、淋巴细胞亚群的测定及其在临床医学中的实用意义 214

第十一章 免疫细胞化学在神经科学中的应用 222

一、确定神经递质的性质、定位和分布 222

二、探查和发现新的神经递质 223

三、追踪神经束的行径及其投射区 223

四、区别神经细胞、神经胶质细胞和内分泌细胞 224

五、研究神经递质的超微结构定位 225

六、神经递质共存的研究 227

七、个体和种族发育的研究 228

八、与神经组织培养技术相结合进行神经生物科学的研究 228

十、神经系统的机能研究 229

九、应用于受体的研究 229

第十二章 肿瘤免疫细胞化学 231

第一节 神经肿瘤免疫细胞化学 231

一、细胞骨架中的中间丝蛋白 231

(一)神经细丝酸性蛋白 231

(二)神经细丝 232

二、神经特异性烯醇化酶 232

三、S-100蛋白 232

第二节 神经内分泌肿瘤免疫细胞化学 233

一、垂体腺瘤 234

(一)生长激素腺瘤 234

(二)催乳激素腺瘤 234

(七)无功能活性腺瘤 235

(六)多种激素性腺瘤 235

二、胰岛细胞瘤 235

(三)促甲状腺激素腺瘤 235

(四)促肾上腺皮质激素腺瘤 235

(五)促性腺激素腺瘤 235

三、甲状腺髓样癌 236

四、肺支气管类癌及肺小细胞癌 236

五、食管燕麦细胞癌 236

六、皮肤神经内分泌癌(Merker细胞瘤) 236

第三节 软组织与骨肿瘤免疫细胞化学 237

一、常用标记抗体 237

(二)肌源性肿瘤的免疫细胞化学标记 238

(三)血管源肿瘤免疫细胞化学标记 238

(一)纤维组织与纤维组织细胞性肿瘤免疫细胞化学标记 238

二、软组织肿瘤免疫组织化学 238

(四)双向分化的软组织肿瘤免疫细胞化学标记 239

(五)脂肪源肿瘤免疫细胞化学标记 239

(六)外周神经肿瘤免疫细胞化学标记 240

(七)组织发生未定的软组织肿瘤 240

三、骨及软骨肿瘤免疫细胞化学标记 240

第四节 免疫活性细胞及其肿瘤的免疫细胞化学 241

一、免疫活性细胞的免疫细胞化学 241

(一)B淋巴细胞 241

(二)T淋巴细胞 242

(三)NK细胞／K细胞 243

(二)恶性淋巴瘤与非淋巴网状组织肿瘤的鉴别 244

(一)恶性淋巴瘤与淋巴网状组织反应性增生的鉴别诊断 244

(四)单核／巨噬细胞与网状细胞 244

二、恶性淋巴瘤的免疫细胞化学标记 244

(三)恶性淋巴瘤的免疫功能分型 245

(四)在恶性淋巴瘤免疫表型分析中的注意事项 245

第五节 上皮组织肿瘤免疫细胞化学 246

一、角蛋白 247

(一)角蛋白抗体及其在肿瘤病理学中的应用 247

(二)有关方法学的应注意的问题 249

二、器官特异性及其它肿瘤标记物 250

(一)上皮膜抗原 251

(二)桥粒蛋白 251

(三)癌胚抗原 251

(七)CA125 252

(八)神经元特异性烯醇化酶 252

(四)甲胎蛋白 252

(六)CA19-9及CA50 252

(五)前列腺特异性抗原和前列腺酸性磷酸酯酶 252

(九)甲状腺球蛋白和降钙素 253

(十)血型抗原 253

第十三章 消化器官免疫细胞化学 256

第一节 胃肠道粘膜免疫细胞化学特点 256

一、抗原的稳定性 256

二、抗体的特异性 257

三、染色技术的选择性 257

第二节 胃肠道粘膜抗体产生细胞 258

一、抗体产生细胞的特点 258

四、结果的可比性 258

二、双标记免疫荧光染色 259

三、临床意义 260

第三节 消化道分泌性IgA 262

一、SIgA的合成及其功能 262

二、对比免疫荧光染色 262

三、临床意义 263

第四节 胃肠道粘膜T淋巴细胞 264

一、T淋巴细胞分布及其特点 264

二、研究方法 265

三、临床意义 266

一、癌胚抗原的特点 267

第五节 癌胚抗原的免疫细胞化学 267

二、癌胚抗原免疫细胞化学染色 268

三、临床意义 269

第六节 胃肠道溶菌酶 269

一、溶菌酶在胃肠道的分布 269

二、溶菌酶的免疫细胞化学染色特点 269

三、溶菌酶研究的临床意义 270

第七节 消化管壁内神经丛的免疫细胞化学 271

一、内源性神经的结构 271

(一)神经丛的模式 272

(二)神经元的数目和大小 272

(三)神经细胞的类型 272

一、乙型肝炎免疫细胞化学 273

第八节 肝脏疾病免疫细胞化学 273

二、消化道全层铺片技术 273

(一)乙型肝炎的免疫反应发病机理 274

(二)乙型肝炎与自身免疫反应 275

(三)乙型肝炎肝细胞内病毒抗原的定位及分布 276

二、肝硬变免疫细胞化学 277

(一)肝硬变组织内HBV抗原的定位及分布 277

(二)肝硬变组织内纤维结合蛋白(FN)的定位及分布 278

(三)肝硬变组织内Ⅲ型胶原的定位及分布 278

(四)肝硬变组织内角蛋白定位及分布 278

三、肝癌免疫细胞化学 279

(一)HBV与原发性肝癌的流行病学证据 279

(三)肝细胞肝癌及癌周肝组织内HBV抗原的分布 280

(二)肝硬变与肝癌的关系 280

(四)肝内胆管细胞癌及癌周肝组织内HBV抗原的分布 282

(五)肝细胞癌中的HBV的分子生物学 282

(六)肝癌发生中HBV分子遗传学及免疫机理 283

第十四章 肾脏疾病免疫细胞化学 286

第一节 免疫细胞化学技术在肾脏疾病中的应用范围 286

一、肾脏组织的检查 286

(一)免疫荧光细胞化学技术的应用 286

(二)免疫酶标细胞化学技术的应用 288

(三)电镜免疫细胞化学技术的应用 289

二、血清或肾脏洗脱液的检查 289

三、尿液的检查 290

四、肾小球细胞的体外培养 290

二、肾小球系膜区 291

一、肾小球毛细血管壁 291

第二节 荧光或酶标抗体在肾脏内显示的部位及形式 291

三、肾小球毛细血管壁及系膜区 292

四、新月体内 292

五、肾小球球囊腔 292

六、肾小管 292

七、小动脉 292

八、肾间质 292

第三节 免疫细胞化学技术在肾脏疾病中应用的意义 292

一、免疫荧光或免疫酶标技术在肾脏疾病中应用的意义 292

(一)肾小球疾病发病机制的研究 292

(二)判断肾脏疾病是否为免疫性疾病 293

(四)其它 294

(三)有助于某些肾小球疾病的确诊 294

二、免疫电镜技术在肾脏疾病中应用的意义 295

第四节 各种肾脏疾病的病变以及免疫荧光(酶标)表现特征 296

一、原发性肾小球疾病 296

二、继发于全身性疾患的肾小球疾病 297

三、结缔组织病时的肾脏损害 298

四、血管性疾患导致肾脏的损害 298

五、代谢性疾患引起的肾脏损害 298

六、某些特殊疾病时的肾脏损害 299

七、遗传性和先天性肾病 299

八、杂病 299

九、肾移植 300

十、肾小管间质性疾病 300

第十五章 自身抗体的免疫组织化学检测方法和应用 302

第一节 自身抗体的免疫组织化学检测方法 303

一、抗核抗体的检测 305

第二节 在研究和诊断自身免疫性疾病中的应用 305

二、双链DNA抗体的检测方法和应用 308

三、抗核仁抗体的检测法 309

四、抗组蛋白抗体的检测方法 309

五、抗着丝点抗体的检测方法 309

六、抗甲状腺自身抗体的检测方法 310

七、平滑肌抗体的检测 311

八、肝细胞膜抗体的检测 312

九、线粒体抗体 313

十、胃壁细胞抗体的检测 314

十一、胃泌素细胞抗体的检测 314

十四、抗皮肤成分自身抗体的检测 315

十二、胰岛细胞抗体的检测 315

十三、抗肾小球和肺泡基底膜抗体的检测 315

十五、唾液腺外分泌导管上皮自身抗体的检测 316

十六、抗横纹肌自身抗体的检测 316

十七、肾上腺自身抗体的检测 317

十八、类风湿因子的检测 317

十九、抗中性白细胞胞浆自身抗体 318

二十、增殖细胞核抗原抗体 318

二十一、抗类风湿关节炎相关核抗原的抗体 319

二十二、抗精子抗体 319

二十三、其他自身抗体的检测 319

三、独特型-抗独特型网络缺陷学说 320

二、T细胞旁路学说 320

一、自身淋巴细胞免疫调控反应紊乱学说 320

第三节 自身抗体产生的机理 320

四、遗传因素 321

第十六章 病原体的免疫细胞化学快速检查方法和应用 323

第一节 在细菌学中的应用 323

一、甲组溶血性链球菌的快速检查法 325

(一)试剂制备 325

(二)检查方法 325

三、霍乱弧菌和副霍乱弧菌的快速检查法 326

六、致病性大肠杆菌的快速检查法 326

四、鼠疫杆菌的快速检查法 326

五、炭疽杆菌的快速检查法 326

(二)检查方法 326

(一)制备荧光抗体 326

二、脑膜炎双球菌的快速检查法 326

七、结核杆菌的快速诊断方法 327

八、其他细菌的快速检查方法 327

九、钩端螺旋体的检查法 327

十、梅毒螺旋体的检查法 327

(一)抗原制备 327

(二)荧光抗体 328

(三)间接免疫荧光染色方法(FTA试验) 328

(四)荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验 328

(五)梅毒螺旋体的直接检查法 328

第二节 在病毒学中的应用 328

一、病毒抗原定位 328

五、病毒的快速诊断 329

四、病毒计数 329

二、病毒感染过程 329

三、肿瘤与病毒 329

(一)病毒的检查 330

(二)抗体的检查 331

(三)常见病毒的快速检查方法 331

第三节 在寄生虫学中的应用 332

一、血吸虫病 332

(一)抗原 332

(二)待检血清 332

(三)荧光抗体 332

(四)检查方法 332

二、疟疾 332

六、弓形虫病 333

七、旋毛虫病 333

三、阿米巴病 333

五、丝虫病 333

四、锥虫病 333

八、其他寄生虫病 334

第四节 在真菌学中的应用 334

第十七章 免疫细胞化学在皮肤病学的应用 335

第一节 角阮细胞 335

一、对角质层抗原与角质层自身抗体、角蛋白抗原的研究 335

二、对天疱疮的研究 335

三、HLA-DR抗原 336

五、其它 337

四、凝集素受体 337

第二节 黑素细胞及其肿瘤 338

一、正常黑素细胞 338

二、色素痣 338

三、恶性黑素瘤 338

第三节 Merkel细胞 339

一、免疫细胞化学在Merkel细胞起源和功能认识中的作用 339

二、Merkel细胞癌的免疫细胞化学诊断 340

第四节 郎格罕细胞 340

一、研究LC自身的表面标记 341

二、研究皮肤病中LC数量、密度及结构的改变 341

(一)基底膜带的结构 342

(二)病变部位于基底膜带的几种大疱性皮肤病 342

一、基底膜带 342

第五节 真皮与表皮交界 342

二、狼疮带试验 344

第六节 免疫细胞化学技术在真皮纤维化性疾病研究中的应用 345

一、确定细胞外基质成分在真皮中的分布 345

二、研究纤维化皮损中细胞的表型特征和(或)功能状态 345

(一)成纤维细胞 345

(二)肌纤维母细胞(Myofibroblast) 346

(三)单一核浸润细胞 346

(四)内皮细胞和肥大细胞 346

三、检测与纤维化发生有关的细胞因子 346

二、B淋巴细胞和免疫球蛋白的表达 347

一、T淋巴细胞及其亚群的免疫表达 347

第七节 真皮浸润细胞免疫表达 347

四、其它 347

三、其它 348

第八节 汗腺及腺肿瘤的免疫细胞化学特点 348

第十八章 核酸分子杂交技术概述 354

第一节 核酸的分子结构 354

一、核酸的化学组成 354

二、核酸的一级结构 355

三、核酸的高级结构 356

(一)DNA 356

(二)RNA 357

四、基因组织 357

一、DNA变性 359

第二节 DNA的变性与复性 359

二、复性 360

第三节 分子杂交 362

一、概述 362

二、探针-鞍反应 363

三、核酸探针的种类 364

(一)DNA探针 364

(二)cDNA探针 365

(三)RNA探针 365

(四)寡核苷酸探针 366

四、核酸探针的标记和检测 367

(一)核酸探针的常用酶促标记技术 368

(二)核酸探针的非放射性标记技术 369

(三)非放射性探针的显示体系 370

(一)固相膜核酸分子杂交方法 372

五、核酸分子杂交的类型 372

(二)固相核酸分子杂交类型 374

(三)固相膜核酸杂交的几点说明 378

(四)液相核酸分子杂交类型 378

六、核酸分子杂交实验因素的优化 379

(一)探针的选择 379

(二)探针的标记方法 380

(三)探针的浓度 380

(四)杂交率 380

(五)杂交最适温度 381

(六)杂交的严格性 382

(八)杂交促进剂 383

(七)杂交反应时间 383

第四节 石蜡包埋组织的DNA提取及其应用 384

一、石蜡包埋组织DNA提取的基本方法 384

二、影响DNA提取质量的因素 386

三、提高DNA提取质量的方法 387

四、石蜡包埋组织DNA分析的方法学 388

五、分子病理学研究中的应用 389

第十九章 核酸(基因)分子探针 394

第一节 概述 394

第二节 核酸(基因)探针目的核酸的制备技术 395

一、特异性目的核酸(或基因)的制备 395

一、缺口平移法 396

二、末端标记法 396

二、目的核酸的扩增 396

第三节 放射性同位素标记核酸探针 396

三、应用特异单引物法标记DNA探针 397

四、双引物法标记DNA探针法 398

五、聚合酶链反应(PCR)标记高活性DNA探针 398

第四节 非放射性标记核酸探针 398

一、生物素标记核酸探针方法 399

二、光敏生物素标记核酸探针 399

三、生物素-补骨脂素(Biorin-psoralen)标记法 400

四、生物素-α-氨基乙酸-N-羟基琥珀标记化学修饰的DNA法 400

五、缺口平移法标记生物素DNA探针(二步法) 400

六、生物素随机引物标记探针方法 401

七、异羟基洋地黄甙Digoxigenin标记核酸探针 401

十、生物素化的RNA探针标记 402

十一、辣根过氧化物酶标记核酸探针法 402

八、光敏2，4-二硝基苯(光敏DNP)标记DNA法 402

九、三硝基苯磺酸(TNBS)标记核酸探针 402

十二、用聚合酶链反应标记高活性DNA探针 403

第五节 寡核苷酸探针的制备 403

第二十章 原位杂交组织化学 406

第一节 原位杂交组织化学概述 406

一、核酸杂交技术 406

二、原位杂交组织化学技术的由来及发展 406

三、原位杂交组织化学技术的基本方法 408

(一)固定 408

(二)玻片和组织切片的处理 409

(三)杂交(Hybridisation) 410

(六)对照试验和ISHH结果的判断 413

(五)显示(Visualization) 413

(四)杂交后处理(Post hybridisation treatment) 413

第二节 cRNA探针在原位杂交组织化学(ISHH)中的应用 414

一、同位素标记cRNA探针在ISHH中的应用 415

(一)组织切片的原位杂交细胞化学方法 415

(二)培养细胞的原位杂交细胞化学方法 417

二、生物素cRNA探针在原位杂交组织化学中的应用 417

(一)光敏生物素标记cRNA探针的应用 417

(二)酶促生物素标记cRNA探针的应用 418

三、地高辛标记cRNA探针的应用 418

(一)基本原理 418

(二)基本操作步骤 419

一、DNA探针的应用 421

(一)地高辛-碱性磷酸酶(Dig-AKP)标记DNA探针在石蜡包埋切片检测病毒DNA中的应用 421

第三节 DNA及寡核苷酸探针在原位杂交组织化学中的应用 421

(二)荧光标记DNA探针的应用 422

二、寡核苷酸探针的应用 426

(一)地高辛标记寡核苷酸探针的应用 426

(二)同位素标记寡核苷酸探针的应用 427

第四节 原位杂交组织化学与免疫细胞化学结合法 427

一、同位素原位杂交组化与免疫组化PAP法的联合程序 428

二、非同位素原位杂交组化与免疫组化联合法 429

第五节 原位杂交免疫细胞化学技术的未来与展望 430

一、PCR与原位杂交细胞化学结合法 431

二、快速原位杂交细胞化学技术 432

三、原位启动标记法 432

(一)染色体的形态结构 435

一、有关染色体的基本知识及制片 435

第一节 原位杂交技术在染色体铺片的应用 435

第二十一章 原位杂交技术在染色体和电镜水平的应用 435

(二)染色体G显带技术 438

(三)高分辨染色体G带技术 438

(四)外周血培养及染色体制片技术 439

二、应用ISHH技术对染色体制片、基因分配(Chromosomal assignment of genes)的研究 441

(一)基本原理 441

(二)操作步骤(Bhatt and McGee,1990) 442

三、利用ISHH技术对肿瘤或癌前组织的细胞间期染色体铺片进行研究 443

(一)基本原理 443

(二)基本操作方法 443

(一)基本原理 445

(二)基本操作方法 445

四、利用性染色体特异性DNA探针的ISHH技术 445

第二节 原位分子杂交技术在电镜水平的应用 447

一、应用同位素标记cRNA探针电镜原位杂交技术于染色体制片(Hutchison et al 1982) 447

二、应用生物素标记DNA探针电镜原位杂交技术 448

(一)基本原理 448

(二)应用生物素标记DNA探针-PA-gold电镜杂交技术(Binder et al 1986) 448

三、应用地高辛标记rRNA探针的电镜原位杂交技术 450

(一)基本原理 450

(二)基本操作方法(FischerD,et al 1992) 450

四、结语 452

第二十二章 聚合酶链反应(PCR)技术的发展和应用 454

第一节 概述 454

第二节 PCR技术的原理 454

一、PCR操作范例 455

第三节 PCR操作范例及反应体系的组成 455

二、PCR反应系统的组成 456

(一)PCR缓冲液(PCR Buffer) 456

(二)四种脱氧三磷酸核苷酸(4×dNTPs) 457

(三)引物的量 457

(四)TaqDNA聚合酶的量 457

(五)模板 458

(六)石蜡油 458

三、电泳分析 458

第四节 影响PCR的主要因素 459

一、温度循环参数 459

二、引物与引物设计 460

三、DNA聚合酶 461

四、影响PCR特异性的因素 463

五、扩增平坡 464

第五节 PCR各种应用模式 464

一、兼并引物(Degenerate primer)PCR 465

二、套式引物(Nested primer)PCR 465

三、复合PCR(Multiplex PCR) 466

四、反向PCR(Inverse PCR或Reverse PCR) 466

五、不对称PCR(Asymmetric PCR) 466

六、标记PCR(LP-PCR)和彩色PCR 466

七、加端PCR 467

八、锚定PCR或固定PCR 467

九、玻片PCR 467

十、反转录PCR方法检测RNA 468

一、样品处理 469

十一、定量PCR 469

第六节 样品处理与注意事项 469

二、注意事项 471

第七节 PCR仪器的发展 472

第八节 PCR临床应用领域及特点 473

一、PCR应用特点 473

二、PCR应用领域 473

第九节 其它链扩增技术及应用范围 474

一、免疫PCR 474

二、转录依赖的扩增系统(Transcription-based amplification system,TAS) 475

三、再生式序列复制技术(3SR) 475

四、连接酶链式反应(Ligase chain reaction,LCR) 476

五、PCR-SSCR分析技术 476

六、结语 477

第二十三章 DNA重组技术及其在基因诊断中的应用 479

第一节 工具酶 479

一、DNA限制性内切酶 479

(一)命名原则 479

(二)分类和特性 480

二、甲基化酶 481

二、分子克隆化的另一些酶 483

(一)DNA聚合酶 483

(二)RNA聚合酶 483

(三)反转录酶 484

(四)核酸外切酶 484

(十)碱性磷酸酯酶 485

(九)末端转移酶 485

第二节 分子克隆载体 485

(六)DNA酶 485

(七)RNA酶 485

(五)核酸酶S1 485

(八)连接酶 485

一、质粒 486

(一)大肠杆菌质粒 486

(二)真核生物中的质粒 487

二、噬菌体和病毒载体 487

(一)噬菌体λ载体的构建 488

(二)单链噬菌体载体 488

(四)逆转录病毒 489

三、柯斯质粒 489

(三)猴病毒40(SV40) 489

四、其他载体 490

(一)转座子载体 490

(二)人工微小染色体 491

第三节 DNA重组实验中常用的技术 492

一、质粒DNA的提取及鉴定 492

(一)质粒DNA的小量制备 492

(二)质粒DNA的大量制备 492

(三)质粒DNA的鉴定 493

二、DNA的重组 493

(一)DNA的酶切与连接 493

(二)大肠杆菌感受态的制备及重组DNA的转化 493

(四)转化子DNA的酶切鉴定 494

(五)重组子DNA的进一步鉴定 494

(三)转化子DNA的快速鉴定--快速细胞破碎法 494

三、地高辛配基随机标记DNA探针法 495

(一)概述 495

(二)试剂盒成份 495

(三)需配制的溶液 496

(四)操作方法 496

(五)排除实验中问题的方法 498

四、核酸的分子杂交 498

(一)斑点杂交的直接点样法 498

(二)DNA的吸印转移法(Southern blot) 499

(一)白细胞DNA的制备 500

五、真核酸细胞基因组DNA的制备 500

(四)硝酸纤维膜固相杂交 500

(三)RNA的吸印转移法(Northern bolt) 500

(二)组织DNA的制备 501

六、转移基因 502

第四节 遗传病与肿瘤的基因诊断 504

一、分离基因进行结构分析 504

二、DNA限制性片段多态性连锁分析 504

三、聚合酶链反应 507

第五节 “DNA指纹”与法医鉴定 508

附录一 免疫细胞化学常用试剂介绍 510

附录二 原位杂交组织化学常用试剂及处理 526

附录三 全血细胞培养染色体技术常用试剂配制 541

附录四 实验室常用技术参数资料 544

本书常用缩写词 571