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目录 1

第1章 大肠杆菌、质粒和噬菌体 1

1.1.1 极限培养基 2

1.1 培养基及细菌学常用工具的准备 2

1.1.3 固体培养基 3

1.1.2 丰富培养基 3

1.1.4 顶层琼脂培养基 4

1.1.6 实验工具 5

1.1.5 穿刺琼脂培养基 5

1.2.3 基本方案3细菌培养的监测 6

1.2.2 基本方案2大体积培养 6

1.2 在液体培养基中培养 6

1.2.1 基本方案1过夜培养 6

1.3.2 基本方法2通过平板划线法分离单菌落 7

1.3.1 基本方案1通过连续稀释法滴定和分离细菌菌落 7

1.3 在固体培养基中培养 7

1.3.5 辅助方案2菌株的保存和复苏 8

1.3.4 辅助方案1影印平板 8

1.3.3 基本方案3通过铺平板分离单个菌落 8

1.4 经典细菌遗传学选论 9

1.5 质粒图谱 13

1.6.2 备择方案96孔微量滴定板碱裂解法 17

1.6.1 基本方案1碱裂解小量制备法 17

1.6 质粒DNA的小量制备 17

1.6.3 基本方案2煮沸小量制备法 18

基本方案1 碱裂解法 19

1.7.1 粗制裂解物的制备 19

1.6.4 辅助方案质粒DNA的保存 19

1.7 质粒DNA的大量制备 19

基本方案2 氯化铯／溴化乙锭平衡离心法 20

1.7.2 备择方案利用离子交换层析和分子筛层析纯化质粒DNA 21

1.8.1 基本方案1CaCl2转化法 22

1.8 将质粒DNA导入细菌细胞 22

1.8.3 基本方案2高效率的电转化方法 23

1.8.2 备择方案一步法制备和转化感受态细菌 23

1.9.1 丝状噬菌体载体的发展和应用 25

1.9 源于丝状噬菌体的载体 25

基本方案利用辅助噬菌体从质粒制备单链DNA 27

1.1 0M13噬菌体衍生载体的制备和应用 27

第2章 DNA的制备和分析 29

2.1 水溶液中DNA的纯化和浓缩 30

2.1.3 辅助方案1酚的平衡及酚／氯仿／异戊醇的配制 31

2.1.2 备择方案1异丙醇沉淀DNA 31

2.1.1 基本方案DNA的酚抽提和乙醇沉淀 31

2.1.4 辅助方案2丁醇浓缩DNA 32

2.1.6 备择方案2玻璃珠法纯化DNA 33

2.1.5 辅助方案3醚抽提法去除残存酚、氯仿或丁醇 33

2.1.7 备择方案3RNA及DNA稀溶液的纯化和浓缩 34

基本方案 35

2.2 从哺乳动物组织中制备基因组DNA 35

2.1.8 备择方案4乙醇沉淀法去除低分子量的寡核苷酸和核苷三磷酸 35

2.3.1 基本方案氯化铯离心法制备植物DNA 36

2.3 从植物组织中制备基因组DNA 36

2.3.2 备择方案用CTAB制备植物DNA 37

2.4.2 备择方案氯化铯法大规模制备细菌基因组DNA 39

2.4.1 基本方案细菌基因组DNA的小量制备 39

2.4 从细菌中制备基因组DNA 39

2.4.3 辅助方案从所得到的基因组DNA制备物中除去多糖 40

2.5A.1 基本方案大片段DNA在琼脂糖凝胶上的分离 41

2.5A 琼脂糖凝胶电泳 41

2.5A.2 辅助方案微型凝胶及中型凝胶 42

2.5B.1 基本方案倒转电场凝胶电泳 43

2.5B 脉冲场凝胶电泳 43

2.5B.2 备择方案钳位均匀电场电泳（CHEF电泳） 44

2.5B.3 辅助方案高分子量DNA样品和分子量标准物的制备 45

2.6.1 基本方案1琼脂糖凝胶电洗脱 46

2.6 从琼脂糖凝胶中分离和纯化大的DNA限制性酶切片段 46

2.6.2 基本方案2NA-45纸电泳 47

2.6.3 基本方案3用低熔点琼脂糖凝胶分离DNA片段 48

2.6.5 备择方案2用玻璃珠法从低熔点琼脂糖凝胶中回收DNA 49

2.6.4 备择方案1使用β-琼脂糖酶消化法从低熔点琼脂糖凝胶中回收DNA 49

2.7.1 基本方案 50

2.7 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 50

2.6.6 辅助方案用溴化乙锭斑点定量法对DNA浓度进行快速估测 50

2.7.3 备择方案2DEAE膜电洗脱法纯化标记片段 52

2.7.2 备择方案1通过电洗脱从聚丙烯酰胺凝胶纯化片段 52

基本方案 54

2.8 筛分型琼脂糖凝胶电泳 54

2.7.4 辅助方案可重复使用的用于凝胶加样的塑料毛细管 54

2.9A.1 基本方案用高盐缓冲液在尼龙膜或硝酸纤维素膜上进行Southern印迹 55

2.9A Southern印迹法 55

2.9A.2 辅助方案紫外透射仪的校准 57

2.9A.4 备择方案2用向下毛细管转移法进行Southern印迹 58

2.9A.3 备择方案1用碱性缓冲液在尼龙膜上进行Southern印迹 58

2.9A.5 备择方案3从聚丙烯酰胺凝胶至尼龙膜的电转印法 59

2.9B.1 基本方案用多样抽滤加样器在不带电荷的尼龙膜和硝酸纤维素膜上进行DNA斑点和狭线印迹 60

2.9B DNA的斑点和狭线印迹 60

2.9B.2 备择方案1用多样抽滤加样器在带正电荷的尼龙膜上进行DNA斑点和狭线印迹 61

2.10 DNA印迹的杂交分析 62

2.9B.3 备择方案2DNA斑点印迹的手工制备 62

2.10.1 基本方案放射性标记的DNA探针对DNA印迹的杂交分析 63

2.10.2 备择方案用放射性标记的RNA探针对DNA印迹进行杂交分析 67

2.10.3 辅助方案从杂交膜上除去探针 68

基本方案 69

2.11 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化寡核苷酸 69

第3章 DNA和RNA的酶学操作 72

3.1.1 基本方案单酶单DNA样品消化 73

3.1 限制性内切酶消化DNA 73

3.1.2 备择方案1多限制性内切酶消化DNA样品 76

3.1.5 辅助方案DNA的甲基化 77

3.1.4 备择方案3限制性内切酶对DNA样品的部分消化 77

3.1.3 备择方案2消化多个DNA样品 77

基本方案 79

3.3 用限制酶部分消化进行DNA作图 79

3.2 用多种酶消化进行DNA作图 79

基本方案 79

3.4.2 10×酶缓冲液 80

3.4.1 贮液 80

3.4 核酸操作的常用试剂和放射性同位素 80

3.4.3 酶反应条件及应用 82

3.4.4 核苷三磷酸（NTP） 85

基本方案酸沉淀法测定DNA和RNA中的放射性 86

3.4.5 标记核酸的放射性同位素 86

备择方案柱离心法分离放射性标记DNA 87

3.5 依赖于DNA的DNA聚合酶 88

基本方案3 随机寡核苷酸引物介导的DNA标记 90

基本方案2 修复突出的3′或5′末端以产生平端 90

3.5.1 大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段 90

基本方案1 标记DNA的3′末端 90

3.5.2 T4DNA聚合酶 91

Klenow酶的其他应用 91

3.5.3 天然T7DNA聚合酶 92

3.5.5 TaqDNA聚合酶 93

3.5.4 经修饰的T7DNA聚合酶 93

3.6 不依赖于模板的DNA聚合酶末端脱氧核苷酸转移酶（末端转移酶） 94

3.7 依赖RNA的DNA聚合酶反转录酶 95

噬菌体的RNA聚合酶：SP6、T7和T3 96

3.8 依赖DNA的RNA聚合酶 96

3.10.1 碱性磷酸酶 97

3.10 磷酸酶和激酶 97

3.9 不依赖DNA的RNA聚合酶*poly（A）聚合酶 97

其他应用 98

基本方案2 交换反应标记5′端 98

3.10.2 T4多核苷酸激酶 98

基本方案1 正向反应标记5′端 98

3.11.3 双链3′→5′外切核酸酶 99

3.11.2 双链5′→3′末端外切核酸酶 99

3.11 外切核酸酶 99

3.11.1 单链5′→3′和3′→5′外切核酸酶 99

3.12.1 Bal31核酸酶 100

3.12 内切核酸酶 100

3.12.4 微球菌核酸酶 101

3.12.3 绿豆核酸酶 101

3.12.2 S1核酸酶 101

3.12.5 脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ） 102

3.13.2 核糖核酸酶H 103

3.13.1 核糖核酸酶A（RNaseA） 103

3.13 核糖核酸酶 103

3.14.1 T4DNA连接酶 104

3.14 DNA连接酶 104

3.13.3 核糖核酸酶T1 104

3.16.1 基本方案 105

3.16 DNA片段的亚克隆 105

3.14.2 大肠杆菌DNA连接酶 105

3.1 5RNA连接酶 105

T4RNA连接酶 105

3.16.2 备择方案凝胶块中DNA片段的连接 107

基本方案 DNA片段亚克隆 108

3.17 聚合酶链式反应构建重组DNA 108

3.18.1 基本方案1用切口平移法制备生物素酰化的探针 112

3.18非同位素探针的标记和比色检测 112

3.18.2 基本方案2用随机寡核苷酸引物合成法制备生物素酰化探针 113

3.18.3 辅助方案生物素酰化探针的比色法检测 114

3.18.4 备择方案制备和检测地高辛标记的DNA探针 115

3.19.1 基本方案生物素标记探针的化学发光检测 116

3.19 非同位素探针的化学发光检测 116

3.19.2 备择方案地高辛标记探针的化学发光检测 118

3.19.3 辅助方案紫外光源的标化 119

第4章 RNA的制备和分析 120

4.1.1 基本方案 121

4.1 从组织培养细胞中提取细胞质RNA 121

4.1.2 辅助方案除去混杂的DNA污染 122

4.2.1 基本方案CsCl法纯化从培养细胞中提取的RNA 123

4.2 异硫氰酸胍法制备总RNA 123

4.2.2 备择方案1CsCl纯化组织RNA 124

4.2.3 备择方案2从组织或培养细胞中一步法分离RNA 125

基本方案 126

4.3 酚／SDS法制备植物RNA 126

4.4.1 基本方案1从革兰氏阴性细菌中分离高质量的RNA 127

4.4 制备细菌RNA 127

4.4.2 基本方案2从革兰氏阳性细菌分离RNA 128

4.4.3 备择方案从革兰氏阴性菌中快速分离RNA 129

基本方案 130

4.5 poly（A）+RNA的制备 130

4.6.1 基本方案用M13模板进行mRNA的S1作图 131

4.6 用单链DNA探针进行mRNA的S1核酸酶作图分析 131

4.6.3 备择方案2用寡核苷酸探针进行mRNA的定量S1作图分析 134

4.6.2 备择方案1从双链模板合成单链探针 134

4.6.4 辅助方案S1核酸酶mRNA定量分析的实验对照 135

4.7.1 基本方案 136

4.7 核酸酶保护试验 136

4.7.2 辅助方案1RNA探针的提纯 137

基本方案 138

4.8 引物延伸 138

4.7.3 辅助方案2模板DNA的制备 138

4.9.1 基本方案甲醛-琼脂糖凝胶电泳分离RNA的Northern杂交 141

4.9 RNA的Northern印迹和狭线杂交分析 141

4.9.2 备择方案1经戊二醛／二甲基亚砜变性处理的RNA的Northern杂交 144

4.9.3 备择方案2经狭线印迹固定的未分级RNA样品的Northern杂交 145

第5章 重组DNA文库的构建 147

5.1 基因组DNA文库概述 148

5.1.2 亚基因组文库 149

5.1.1 表现度与随机性 149

5.2 cDNA文库概述 150

5.1.3 基因组DNA文库载体 150

基本方案 151

5.3 噬菌体文库的扩增 151

基本方案 152

5.4 粘粒和质粒文库的扩增 152

第6章 重组DNA文库的筛选 154

基本方案 156

6.1 噬菌体文库的铺平板和转移 156

基本方案 158

6.2 粘粒及质粒文库的铺平板和转移 158

6.3.1 基本方案在甲酰胺溶液中进行杂交 159

6.3 应用DNA片段作探针 159

6.4.1 基本方案1在氯化钠／柠檬酸钠溶液（SSC）中杂交 160

6.4 使用合成寡核苷酸作探针 160

6.3.2 备择方案在水溶液中进行的杂交 160

6.4.2 基本方案2在氯化四甲铵（TMAC）中杂交 161

6.4.3 辅助方案混合寡核苷酸5′末端标记 162

基本方案 164

6.5 噬菌体克隆的纯化 164

6.7.1 基本方案用抗体筛选λgt11表达文库 165

6.7 在λ噬菌体噬斑中产生的融合蛋白的免疫筛选 165

6.6 粘粒和质粒克隆的纯化 165

基本方案 165

6.7.2 备择方案在抗体筛选之前用IPTG诱导融合蛋白表达 166

基本方案 167

6.8 在杂交选择和翻译后进行的免疫筛选 167

6.9.1 YAC文库的构建 169

6.9 概述筛选YAC文库和分析YAC克隆的策略 169

6.9.3 筛选用的基因座特异性PCR试验的设计 171

6.9.2 中心实验室的YAC文库筛选 171

6.9.4 分析独立的YAC克隆 172

6.10 对分离得到的YAC克隆的分析 173

6.9.5 YAC插入片段的亚文库的构建与分析 173

6.10.1 基本方案1含YAC的酵母菌株的培养和保存 174

6.10.2 基本方案2制备YACDNA进行Southern印迹分析 175

6.10.3 基本方案3制备用于脉冲电场凝胶电泳的包埋于琼脂糖胶块中的酵母染色体 176

6.10.4 基本方案4用PCR扩增法进行末端片段分析 177

6.10.5 备择方案采用亚克隆至细菌质粒载体中分析末端片段 180

6.10.6 辅助方案设计和制备pUC19-ES和pUC19-HS亚克隆载体 181

6.10.7 基本方案5制备高分子量的含YAC的酵母DNA 182

6.10.8 基本方案6制备和分析YAC插入片段的亚文库 184

7.0 DNA测序方法概述 185

第7章 DNA序列测定 185

7.0.1 双脱氧测序（Sanger法） 186

7.0.2 化学测序（Maxam-Gilbert法） 188

7.0.3 双脱氧法或化学测序法的选择 189

7.0.4 放射性标记测序反应的备择标记 190

7.1.1 双脱氧测序 191

7.1 DNA测序策略 191

7.1.2 化学测序 192

7.2.1 基本方案1用外切酶Ⅲ构建单向缺失突变体 194

7.2 构建用于DNA测序的嵌套式缺失突变体 194

7.2.3 基本方案2用Bal31核酸酶构建嵌套式缺失突变体 198

7.2.2 辅助方案1用［α-35S］dNTP使DNA免于外切酶Ⅲ消化 198

7.2.4 辅助方案制备M13mp测序载体以亚克隆Bal31消化的DNA片段 203

7.3.1 基本方案1制备单链M13噬菌体DNA 204

7.3 制备DNA测序模板 204

7.3.2 基本方案2从小量裂解物中制备λ噬菌体DNA 205

7.3.3 基本方案3小量制备用于双脱氧测序的双链质粒DNA模板 206

7.3.5 基本方案5制备用于热循环测序质粒或噬菌体DNA 207

7.3.4 基本方案4用于双脱氧测序的双链质粒DNA的碱变性 207

7.4 双脱氧法DNA测序 208

7.4.1 基本方案1用测序酶进行标记／终止测序反应 209

7.4.3 备择方案2使用TaqDNA聚合酶进行Sanger双脱氧测序 213

7.4.2 备择方案1使用Mn2+的标记／终止反应 213

7.4.4 备择方案3用5′末端标记引物一步法进行测序反应 214

7.4.5 基本方案2用α-标记核苷酸进行热循环测序反应 215

7.5 化学发光双脱氧DNA测序法 218

7.4.6 备择方案4用5′末端标记引物进行热循环测序反应 218

7.5.1 基本方案利用生物素标记引物的化学发光DNA测序法 220

7.5.3 备择方案2用半抗原标记引物进行测序并用抗体碱性磷酸酶偶联物进行检测 222

7.5.2 备择方案1链亲和素和生物素酰化碱性磷酸酶两步检测法（间接法） 222

7.6.1 基本方案测序胶的灌制、电泳及处理 224

7.6 用于测序的变性凝胶电泳 224

7.6.2 备择方案1缓冲液梯度测序胶 227

7.6.3 备择方案2电解质梯度测序胶 228

7.7.1 序列数据的录入 229

7.7 DNA和蛋白质序列的计算机处理和分析 229

7.6.4 备择方案3含甲酰胺的测序胶 229

7.7.2 序列数据的确证和组装 232

7.7.3 限制酶作图 235

7.7.4 核酸结构预测 236

7.7.5 寡核苷酸设计策略 237

7.7.6 蛋白质编码区的识别 239

7.7.7 同源性检索 240

附录 243

7.7.8 向分子生物学家提供的基因序列库及其他计算机资源 243

第8章 克隆化DNA的诱变 252

基本方案 253

8.1 无需表型选择的寡核苷酸介导的诱变 253

8.2A 用简并寡核苷酸诱变：在小段DNA序列中产生大量突变 256

基本方案 256

基本方案 259

8.2B 基因合成：用互为引物的长段寡核苷酸合成目的序列 259

8.3.1 基本方案 260

8.3 区域特异性诱变 260

8.4.1 辅助方案用嵌套缺失体和互补寡核苷酸进行接头分区诱变 263

8.4 DNA的接头分区诱变 263

8.3.2 辅助方案突变克隆的富集 263

8.4.2 备择方案寡核苷酸介导的接头分区诱变 265

8.5.1 基本方案1通过PCR引入限制性内切酶位点 266

8.5 利用聚合酶链式反应（PCR）的定点诱变 266

8.5.2 基本方案2利用PCR引入点突变 268

8.5.3 备择方案通过顺序PCR步骤引入点突变 271

第9章 DNA导入哺乳动物细胞 274

9.1.1 基本方案磷酸钙-DNA在HEPES中形成沉淀的转染方法 277

9.1 磷酸钙转染法 277

9.1.3 备择方案在BES中形成磷酸钙-DNA沉淀的高效转染方法 279

9.1.2 辅助方案1哺乳动物细胞的甘油／二甲基亚砜休克 279

9.1.4 辅助方案2质粒DNA的纯化 280

9.2.1 基本方案 281

9.2 利用DEAE-葡聚糖的转染 281

9.2.3 备择方案2悬浮细胞的转染 283

9.2.2 备择方案1DEAE-葡聚糖大批量转染 283

9.3.1 基本方案电穿孔法转染哺乳动物细胞 284

9.3 电穿孔转染法 284

9.2.4 备择方案3用氯喹处理细胞 284

9.3.2 备择方案植物原生质体细胞的电穿孔转染 285

9.4.1 基本方案用脂质体介导短暂表达 286

9.4 脂质体介导的转染 286

9.5.1 基本方案 287

9.5 将基因稳定转染至哺乳动物细胞 287

9.4.2 备择方案用脂质体进行稳定转染 287

9.5.2 哺乳动物细胞的选择标记 288

9.6 遗传报道基因系统概述 290

9.6.1 报道载体的设计 294

9.6.2 体外报道分子分析方法 295

9.6.3 体内报道分子分析方法 298

9.7A.1 基本方案1CAT活性的层析分析法 299

9.7A 报道基因活性的同位素分析方法 299

9.7A.3 备择方案2CAT活性的相-抽提分析法 302

9.7A.2 备择方案1原位裂解细胞的CAT分析方法 302

9.7A.4 基本方案2人生长激素的放射免疫分析法 303

9.7B.1 基本方案1萤火虫荧光素酶报道基因分析 305

9.7B 非同位素分析报道基因活性 305

9.7B.2 备择方案冻融裂解的细胞的荧光素酶分析 306

9.7B.3 基本方案2β-半乳糖苷酶报道基因的化学发光分析 307

9.8.1 转染效率 308

9.8 转染后RNA的直接分析 308

9.9.1 DEAE-葡聚糖转染法 309

9.9 转染条件的优化 309

9.8.2 RNA制备 309

9.8.3 RNA分析 309

9.8.4 启动子强度 309

9.9.2 磷酸钙转染法 310

9.9.4 脂质体介导的转染 311

9.9.3 电穿孔法 311

9.10.1 反转录病毒生活周期 312

9.10 反转录病毒转导系统概述 312

9.10.4 包装细胞系和病毒的产生 315

9.10.3 有复制能力的载体 315

9.10.2 无复制能力的载体 315

9.10.5 安全性问题 316

9.11.1 基本方案1将反转录病毒载体导入包装细胞系 317

9.11 建立特异的反转录病毒产毒细胞系 317

9.11.2 基本方案2测定病毒滴度：高滴度产病毒细胞克隆的鉴定 319

9.11.3 备择方案产毒克隆的快速评价 320

9.12.1 基本方案用离心法制备和浓缩病毒原液 321

9.12 大规模制备和浓缩反转录病毒原液 321

9.11.4 辅助方案培养细胞的Xgal染色 321

9.12.2 备择方案用聚乙二醇均相沉淀及层析法浓缩病毒 322

9.13 反转录病毒原液中辅助病毒的检测 323

9.12.3 备择方案用分子量截留滤膜进行浓缩 323

9.13.1 基本方案通过药物抗性的水平传播分析辅助病毒 324

9.13.2 备择方案用反转录酶分析法检测辅助病毒 325

9.14.2 在体内感染啮齿类动物 326

9.14.1 体外细胞感染 326

9.14 用反转录病毒在体外及体内感染细胞 326

第10章 蛋白质的分析 329

基本方案Bradford法 332

10.1 比色法测定蛋白质含量 332

10.2.1 电与电泳 333

10.2 蛋白质的单向SDS凝胶电泳 333

10.2.2 基本方案1变性（SDS）不连续凝胶电泳：Laemmli凝胶电泳法 334

10.2.3 备择方案1在Tris-Tricine缓冲系统中电泳 338

10.2.4 备择方案2在无尿素条件下用Tris缓冲液分离多肽 340

10.2.5 备择方案3连续SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 341

10.2.6 备择方案4超薄凝胶的灌制和电泳 342

10.2.7 辅助方案1一次灌制多块浓度均一的凝胶 343

10.2.8 备择方案5在梯度凝胶中分离蛋白质 345

10.2.9 辅助方案2一次灌制多块梯度胶 347

10.2.1 0基本方案2在均一浓度的微型凝胶上电泳 349

10.2.1 1辅助方案3制备多块梯度胶 351

10.3 使用O’Farrell系统的双向凝胶电泳 352

10.3.1 基本方案1第1向凝胶（等电聚焦） 353

10.3.2 基本方案2第2向凝胶 354

10.3.3 备择方案1、2（第1向凝胶电泳）极端碱性、酸性蛋白的等电聚焦 356

10.3.5 辅助方案组织来源的蛋白质样品的溶解和制备 357

10.3.4 备择方案3小型凝胶双向电泳 357

基本方案 358

10.4 从已染色的凝胶中电洗脱回收蛋白质 358

10.5.1 基本方案1考马斯亮蓝染色 360

10.5 凝胶中蛋白质的染色 360

10.5.2 基本方案2银染法 361

10.5.3 备择方案非氨盐银染法 362

10.5.4 基本方案3快速银染法 363

10.6.1 基本方案印度墨汁染色 364

10.6 检测转印到膜上的蛋白质 364

10.5.5 辅助方案凝胶拍照 364

10.6.3 辅助方案碱处理增强蛋白质的染色 365

10.6.2 备择方案金染色 365

10.7.1 基本方案1用转移槽转印蛋白质 366

10.7 免疫印迹与免疫检测 366

10.7.2 备择方案1用半干转移系统转印蛋白质 368

10.7.4 基本方案2用第二抗体偶联物进行免疫检测 369

10.7.3 辅助方案转印后蛋白质的可逆染色 369

10.7.6 基本方案3用发色底物显迹 371

10.7.5 备择方案2用亲和素-生物素偶联的第二抗体进行免疫检测 371

10.8 凝胶过滤层析 373

10.7.7 备择方案3用发光底物显迹 373

10.8.1 基本方案蛋白质的凝胶过滤分离 374

10.8.3 辅助方案凝胶介质和层析柱的选择 376

10.8.2 备择方案蛋白质的凝胶过滤脱盐 376

10.9.1 基本方案 377

10.9 离子交换层析 377

10.9.2 辅助方案离子交换层析介质和层析柱的选择 379

10.10.1 基本方案可溶性抗原或膜结合抗原的分离 380

10.10 免疫亲和层析 380

10.10.3 备择方案2低pH洗脱抗原 382

10.10.2 备择方案1抗原的批处理纯化 382

10.11.1 基本方案天然MCAC纯化带组氨酸尾的可溶性融合蛋白 383

10.11 金属螯合亲和层析 383

10.11.2 备择方案1变性条件下用MCAC纯化带组氨酸尾的不溶性融合蛋白 386

10.11.4 辅助方案1已纯化蛋白的分析和处理 387

10.11.3 备择方案2MCAC纯化蛋白的固相复性 387

10.12.1 基本方案多肽和蛋白质的分离 388

10.12 反相高效液相层析 388

10.11.5 辅助方案2NTA介质的再生 388

10.12.3 辅助方案水、缓冲液和溶剂的脱气 390

10.12.2 备择方案蛋白质的分离 390

10.13 离子交换高效液相层析 391

10.13.1 基本方案1阴离子交换HPLC 392

基本方案 393

10.14 分子排阻高效液相层析 393

10.13.2 基本方案2阳离子交换HPLC 393

10.15.1 基本方案用抗体-Sepharose偶联物免疫沉淀放射性标记抗原 394

10.15 免疫沉淀法 394

10.15.2 辅助方案制备抗体-Sepharose偶联物 396

10.15.3 备择方案1用抗Ig血清免疫沉淀放射性标记抗原 397

10.15.4 备择方案2用抗Ig抗体-Sepharose、蛋白A-或蛋白G-Sepharose或金黄色葡萄球菌（S.aureus）免疫沉淀放射性标记抗原 398

10.15.6 备择方案4用抗体-Sepharose琼脂糖偶联物免疫沉淀非标记抗原 399

10.15.5 备择方案3使用更剧烈的解离和洗涤条件的免疫沉淀 399

基本方案 400

10.16 克隆化基因的体外转录和翻译 400

10.17.1 基本方案用［35S］甲硫氨酸短时间标记悬液中的细胞 402

10.17 蛋白质的生物合成标记 402

10.17.3 备择方案2用［35S甲硫氨酸长时间标记细胞 404

10.17.2 备择方案1用［35S］甲硫氨酸短时间标记贴壁培养细胞 404

10.17.5 备择方案4用其他氨基酸进行生物合成标记 405

10.17.4 备择方案3用［35S］甲硫氨酸对细胞进行脉冲追踪标记 405

10.18.1 基本方案1测定在PVDF膜上样品的氨基酸序列 406

10.18 分离蛋白质用于微量序列分析 406

10.17.6 辅助方案TCA沉淀法确定放射性标记的掺入量 406

10.18.2 辅助方案SDS-PAGE准备蛋白质样品 408

10.18.3 基本方案2测定N-末端封闭蛋白质的内部序列 409

第11章 免疫学 411

11.1.1 基本方案辣根过氧化物酶（HRPO）与抗体的偶联 413

11.1 酶与抗体的偶联 413

11.2 酶联免疫吸附测定（ELISA） 414

11.1.2 备择方案碱性磷酸酶与抗体的偶联 414

11.2.1 基本方案用间接ELISA法检测特异性抗体 415

11.2.2 备择方案1直接竞争ELISA法检测可溶性抗原 417

11.2.3 备择方案2抗体夹心ELISA法检测可溶性抗原 418

11.2.4 备择方案3双抗体夹心ELISA法检测特异性抗体 419

11.2.5 备择方案4直接细胞ELISA法检测细胞表面抗原 421

11.2.6 备择方案5间接细胞ELISA法检测对表面抗原具有特异性的抗体 422

11.2.7 辅助方案1交叉连续稀释法确定最佳试剂浓度 424

11.2.8 辅助方案2制备细菌细胞裂解物抗原 425

11.3.1 基本方案1单克隆抗体上清的制备 426

11.3 单克隆抗体上清液和腹水的制备 426

11.3.2 备择方案1单克隆抗体上清的大量制备 427

11.3.4 基本方案2含单克隆抗体的腹水的制备 428

11.3.3 备择方案2大量制备杂交瘤或细胞系 428

11.4.1 基本方案用蛋白A-Sepharose进行纯化 430

11.4 单克隆抗体的纯化 430

11.4.3 备择方案2用抗原-Sepharose和抗鼠Ig-Sepharose进行纯化 431

11.4.2 备择方案1蛋白A-Sepharose的备择缓冲液系统 431

11.5 兔多克隆抗血清的制备 432

11.5.1 基本方案肌肉内注射免疫法 433

11.5.3 备择方案2皮下组织注射免疫法 434

11.5.2 备择方案1皮内注射免疫法 434

11.6 从抗血清、腹水或杂交瘤上清液中纯化IgG抗体 435

11.5.4 备择方案3耳动脉放血 435

11.6.2 备择方案用DEAE-Affi-Gel-Blue层析法分级分离IgG 436

11.6.1 基本方案用硫酸铵沉淀IgG 436

11.7 免疫原性肽的选择 437

11.8.1 基本方案通过化学偶联法用MBS将合成肽偶联到担体蛋白上 439

11.8 抗肽抗体的制备 439

11.8.2 备择方案用戊二醛将合成肽通过化学偶联法偶联到担体蛋白质上 440

第12章 DNA-蛋白质相互作用 442

12.1.1 基本方案核提取物的制备 444

12.1 从哺乳动物细胞中制备核提取物和细胞质提取物 444

12.1.2 辅助方案1细胞核提取方法的优化 446

12.2.1 基本方案低离子强度聚丙烯酰胺电泳迁移率变动分析 447

12.2 DNA结合蛋白在凝胶电泳中的迁移率变动分析 447

12.1.3 辅助方案2细胞质（S-100）组分的制备 447

12.3 甲基化干扰分析法和尿嘧啶干扰分析法 449

12.2.2 备择方案高离子强度聚丙烯酰胺电泳迁移率变动分析 449

12.3.1 基本方案1甲基化干扰分析法 450

12.3.2 基本方案2尿嘧啶干扰分析法 451

12.4.1 基本方案DNA酶Ⅰ足迹分析法 453

12.4 DNA酶Ⅰ足迹分析法 453

12.4.2 辅助方案用光密度及数值分析法决定蛋白质结合的平衡常数 456

12.4.3 备择方案粗制品的DNA酶Ⅰ足迹分析法 458

12.5.1 基本方案用溴脱氧尿苷（BrdU）取代的探针进行紫外交联 459

12.5 蛋白质与核酸的紫外交联 459

12.5.2 备择方案1用非溴脱氧尿苷（NON-BrdU）取代的探针进行紫外交联 461

12.6.1 基本方案 462

12.6 用生物素／链亲和素亲和系统纯化DNA结合蛋白 462

12.5.3 备择方案2原位紫外交联 462

12.6.2 备择方案1用微型柱进行纯化 464

12.7.1 基本方案用识别位点DNA筛选λgt11表达文库 465

12.7 编码DNA结合蛋白的cDNA的检测、纯化和鉴定 465

12.6.3 备择方案2用链亲和素-琼脂糖进行纯化 465

12.7.2 备择方案干燥膜的变性／复性 467

12.7.3 辅助方案从重组溶原菌中制备粗提物鉴定DNA结合蛋白的活性 468

基本方案 469

12.8 用体外合成的蛋白质分析DNA蛋白质相互作用 469

12.9.1 基本方案1DNA亲和介质的制备 470

12.9 序列特异性DNA结合蛋白的亲和层析纯化 470

12.9.2 备择方案将DNA偶联于溴化氰活化琼脂糖上 473

12.9.3 辅助方案1用制备性凝胶电泳纯化寡核苷酸 474

12.9.4 基本方案2DNA亲和层析法 475

12.9.5 辅助方案2非同位素竞争性DNA的选择和制备 477

第13章 酿酒酵母 479

13.1 酵母菌培养基的制备 480

13.1.1 液体培养基 481

13.1.2 固体培养基 483

13.2 酵母菌的培养与操作 486

基本方案冷冻菌种保存液的制备与接种 486

13.1.3 菌株的保存与复苏 486

13.2.3 基本方案3细胞密度检测 487

13.2.2 基本方案2固体培养基培养酵母菌 487

13.2.1 基本方案1液体培养基培养酵母菌 487

13.2.6 基本方案6二倍体细胞的孢子形成 488

13.2.5 基本方案5二倍体细胞的构建 488

13.2.4 基本方案4影印平板检测酵母菌表型 488

13.2.7 基本方案7四分体的制备与剖分 489

13.2.8 辅助方案解剖针的制作 491

13.2.9 备择方案随机孢子分析 492

13.3.1 基本方案甲乙硫醚诱变 493

13.3 酵母菌细胞的诱变 493

13.4 酵母菌的克隆载体与基因图谱 495

13.3.2 备择方案紫外光诱变 495

13.4.1 质粒分类命名 499

13.4.2 精选的质粒和基因图谱 503

13.5 酵母菌表达载体 504

13.6.1 基本方案1研究基因调控的lacZ融合载体 507

13.6 酵母菌载体与表达产物的检测 507

13.6.2 基本方案2β-半乳糖苷酶在液体培养基中的表达与检测 508

13.7.1 基本方案乙酸锂转化 509

13.7 将DNA导入酵母菌细胞中 509

13.7.2 备择方案1原生质体转化 510

13.7.3 备择方案2电穿孔转化 512

13.7.4 辅助方案单链高分子量的担体DNA的制备 514

基本方案 515

13.8 利用互补作用克隆酵母菌基因 515

基本方案 516

13.9 酵母细胞的质粒分离除去 516

13.10.1 基本方案1整合性转化 517

13.10 克隆化酵母DNA的操作 517

基本方案3基因破坏一步法 518

基本方案2整合性破坏 518

13.10.2 基因置换技术 518

基本方案4移换 519

13.10.3 基本方案5质粒缺口修复 520

13.10.4 基本方案6穿梭质粒 521

13.11.1 基本方案从酵母菌中快速分离质粒DNA 522

13.11 酵母DNA的制备 522

13.11.2 备择方案酵母染色体DNA的快速分离 523

13.12.1 基本方案热酸性酚抽提法制备酵母RNA 524

13.12 酵母菌RNA的制备 524

13.12.3 备择方案2poly（A）+RNA的制备 525

13.12.2 备择方案1玻璃珠法制备RNA 525

13.13.1 基本方案原生质体制备及裂解 526

13.13 制备酵母蛋白抽提物 526

13.13.2 辅助方案差速离心法制备细胞核 527

13.13.3 备择方案1玻璃珠破细胞法 528

13.13.4 备择方案2液氮破细胞法 529

13.14 利用相互作用阱／双杂合系统确定相互作用的蛋白质 530

13.14.1 基本方案1鉴定诱饵蛋白的特性 531

13.14.2 基本方案2相互作用蛋白的捕获 534

13.14.3 辅助方案1制备鲑精担体DNA 537

13.14.4 辅助方案2附加的特异性筛选方法 538

14.1 组织、胚胎及单细胞的固定、包埋及切片 539

第14章 原位杂交和免疫组织化学 539

14.1.1 基本方案组织和胚胎的多聚甲醛固定及石蜡包埋 540

14.1.2 备择方案悬浮及培养细胞的PFA固定 541

14.1.4 辅助方案2蜡块中样品的切片 542

14.1.3 辅助方案1成年小鼠的灌流 542

14.2.1 基本方案样品制备及切片 544

14.2 冰冻切片 544

14.1.5 辅助方案3预包被载玻片的处理 544

14.2.2 辅助方案1用于原位杂交的冰冻切片的固定 547

14.2.3 辅助方案2组织固定和蔗糖浸制 548

14.3.1 基本方案石蜡切片或细胞的杂交实验 549

14.3 细胞RNA的原位杂交 549

14.3.2 备择方案冰冻切片的杂交实验 552

14.3.3 辅助方案135S标记的核糖核酸探针和含硫探针竞争剂的合成 554

14.4.2 基本方案2胶乳放射自显影 555

14.4.1 基本方案1胶片放射自显影 555

14.3.4 辅助方案235S标记的双链DNA探针的合成 555

14.4 杂交探针的检测 555

14.4.3 辅助方案放射自显影用稀释胶乳的制备 556

14.5.1 基本方案吉姆萨（Giemsa）染色法 557

14.5 放射自显影原位杂交玻片的复染和压片固定 557

14.5.2 备择方案1苏木精／伊红染色法 558

14.5.4 备择方案3HOECHST染色法 559

14.5.3 备择方案2甲苯胺蓝染色法 559

14.6 免疫组织化学法 560

14.6.1 基本方案1单层生长细胞的免疫荧光标记 561

14.6.2 备择方案1悬浮细胞的免疫荧光标记 562

14.6.3 基本方案2组织切片的免疫荧光标记 563

14.6.4 备择方案2链亲和素-生物素结合物免疫荧光标记法 564

14.6.7 备择方案5组织切片的免疫荧光双标记法 565

14.6.6 备择方案4组织切片的免疫过氧化物酶标记 565

14.6.5 备择方案3组织切片的免疫金标记 565

14.7 用非同位素探针进行原位杂交和检测 566

14.7.1 基本方案1荧光原位杂交 567

辅助方案1 生物素酰化信号的放大 569

14.7.2 杂交信号的放大 569

14.7.3 非同位素标记探针的酶法检测 570

辅助方案2 地高辛标记探针的信号放大 570

备择方案1 辣根过氧化物酶法检测 571

备择方案2 碱性磷酸酶检测法 572

14.8.1 总体设计 573

14.8 低丰度核酸的检测：原位PCR和杂交 573

14.8.2 基本方案1DNA和RNA靶序列的原位PCR扩增 576

14.8.3 备择方案一步法反转录及扩增 579

14.8.4 基本方案2ISPCR扩增的产物的杂交和检测 580

14.8.6 辅助方案2在载玻片上制备原位PCR样品 584

14.8.5 辅助方案1AES浸泡处理载玻片的制备 584

14.8.7 辅助方案3用33P标记寡核苷酸探针 585

第15章 聚合酶链式反应（PCR） 587

基本方案 589

15.1 PCR扩增DNA：标准程序和优化 589

15.2.2 备择方案1单引物重复扩增制备单链模板以用于双脱氧测序 592

15.2.1 基本方案1不对称PCR产生的单链产物的双脱氧测序 592

15.2 利用PCR产物直接进行DNA序列测定 592

15.2.3 备择方案2制备用于双脱氧测序的双链PCR产物 593

15.2.5 基本方案2PCR产物的标记和化学测序 594

15.2.4 备择方案3用λ噬菌体核酸外切酶消化双链PCR产物得到单链进行双脱氧测序 594

15.2.6 备择方案4PCR产物的基因组测序 595

基本方案 596

15.3 通过PCR方法对微量DNA进行定量分析 596

15.4.1 基本方案在最适条件下进行RNA的PCR扩增 598

15.4 PCR扩增RNA 598

15.4.3 备择方案2将cDNA直接用于扩增反应 600

15.4.2 备择方案1避免长时间的共沉淀及退火步骤的方法 600

15.5.1 基本方案连接介导的单侧PCR 601

15.5 用于基因组测序及足迹分析的连接介导PCR 601

15.4.4 辅助方案粗制RNA的快速提取 601

15.5.2 辅助方案1从单层细胞制备基因组DNA以用于DMS足迹分析 605

15.5.3 辅助方案2从悬浮细胞中制备用于DMS足迹分析的基因组DNA 608

15.5.4 辅助方案3用于化学测序的基因组DNA的制备 609

15.6.1 基本方案1扩增已知序列的下游（3′端）区段 611

15.6 利用单侧PCR（锚式PCR）进行cDNA扩增 611

15.6.2 基本方案2扩增已知序列上游（5′端）区段 613

15.7.1 基本方案产生T-A突出端 616

15.7 PCR产物的分子克隆 616

15.7.2 备择方案1产生半位点 618

基本方案 619

15.8 通过PCR差异展示mRNA 619

第16章 蛋白质的表达 625

16.1.1 用大肠杆菌进行基因表达的一般策略 626

16.1 概述：蛋白质在大肠杆菌中表达 626

16.1.2 特定的表达方案 627

16.1.3 基因表达的疑难分析 628

16.2.1 基本方案用双质粒系统进行表达 629

16.2 T7RNA聚合酶／启动子表达系统 629

16.2.2 备择方案1质粒编码蛋白的选择性标记 631

16.3 用带λ噬菌体调节序列的载体进行表达 632

16.2.3 备择方案2通过M13噬菌体mGP1-2感染的表达 632

16.3.1 基本方案1基因表达的温度诱导 633

16.3.3 辅助方案1用pSKF系列载体进行“天然基因”克隆 634

16.3.2 基本方案2基因表达的化学诱导 634

16.3.4 辅助方案2融合基因在pSKF301中的构建和拆分 636

16.4 融合蛋白载体表达概述 638

16.4.1 表达蛋白的可溶性 639

16.4.3 裂解融合蛋白以除去担体蛋白 640

16.4.2 表达蛋白的稳定性 640

16.5.1 基本方案1用Xa因子进行融合蛋白的酶解 641

16.5 融合蛋白的酶解和化学裂解 641

16.5.3 备择方案1用凝血酶进行融合蛋白的酶解 642

16.5.2 辅助方案用Xa因子进行变性融合蛋白的裂解 642

16.5.4 备择方案2与分离介质结合的GST融合蛋白的酶解 643

16.5.5 备择方案3用肠激酶进行融合蛋白的酶解 644

16.5.7 备择方案4用羟胺化学裂解融合蛋白 645

16.5.6 基本方案2用溴化氰对融合蛋白进行化学降解 645

16.5.8 备择方案5低pH下水解融合蛋白进行化学裂解 646

基本方案 647

16.6 lacZ和trpE融合蛋白的表达及纯化 647

基本方案 649

16.7 谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白的表达及纯化 649

16.8.1 基本方案硫氧还蛋白融合蛋白的构建和表达 652

16.8 硫氧还蛋白融合蛋白的表达和纯化 652

16.8.2 辅助方案1用弗氏细胞压碎器裂解大肠杆菌 655

16.8.4 辅助方案3用热处理纯化硫氧还蛋白融合蛋白 657

16.8.3 辅助方案2硫氧还蛋白融合蛋白的渗透性释放 657

16.9.1 杆状病毒表达系统 658

16.9 杆状病毒表达系统的概述 658

16.9.4 用于杆状病毒表达系统的试剂、溶液和设备 660

16.9.3 用杆状病毒表达系统超量表达蛋白的步骤 660

16.9.2 昆虫细胞中蛋白质的翻译后修饰 660

16.10.1 基本方案1昆虫细胞的保存和培养 662

16.10 昆虫细胞培养物及杆状病毒毒种贮液的制备 662

16.10.2 基本方案2杆状病毒毒种贮液的制备 663

16.10.3 辅助方案用蚀斑试验测定病毒贮液的滴度 664

16.11重组杆状病毒的产生和重组蛋白的表达分析 666

16.11.1 基本方案1用野生型病毒线性化DNA共转染 667

16.11.2 备择方案用野生型病毒环状DNA共转染 669

16.11.3 辅助方案1野生型杆状病毒的纯化 670

16.11.4 基本方案2编码β-半乳糖苷酶的重组杆状病毒的纯化 671

16.11.5 辅助方案2裸眼筛选重组杆状病毒 672

16.11.6 基本方案3重组病毒的蛋白质分析 673

16.11.7 辅助方案3重组蛋白质的代谢标记 674

16.11.8 辅助方案4蛋白质生产高峰期的确定 675

16.11.9 基本方案4重组蛋白质的大规模生产 676

16.12.1 病毒介导的基因转移 677

16.12 概述：蛋白质在哺乳动物细胞中表达 677

16.12.3 DNA的稳定转染 678

16.12.2 短暂表达 678

16.12.7 问题的发现与解决 679

16.12.6 表达系统的选择 679

16.12.4 转染DNA的扩增 679

16.12.5 表达载体 679

基本方案 680

16.13 用COS细胞短暂表达蛋白质 680

17.1 蛋白质磷酸化概述 683

第17章 蛋白质磷酸化的分析 683

17.2.1 基本方案培养细胞的32Pi标记和温和去污剂裂解法 684

17.2 培养细胞用32Pi标记和用于免疫沉淀的细胞裂解物的制备 684

17.2.2 备择方案SDS煮沸法裂解细胞 686

17.3.1 基本方案磷酸氨基酸的酸水解和双向电泳分析 687

17.3 磷酸氨基酸分析 687

17.4 分析非标记蛋白质的磷酸化作用 691

17.3.2 备择方案碱处理提高转移至滤膜上的磷酸酪氨酸和磷酸苏氨酸的检测 691

17.4.1 基本方案1用抗磷酸酪氨酸抗体和［125I］标记蛋白A进行免疫印迹分析 692

17.4.2 备择方案用增强化学发光法（ECL）检测结合的抗体 693

17.4.3 基本方案2磷酸酶消化法鉴定磷酸化的蛋白质 694

附录1 试剂和溶液 696

附录 696

附录2 标准测量值、数据和缩写 795

常用缩写 795

实用测量值和数据 801

核酸的特性 807

放射性 817

离心机和转子 819

附录3 生物化学和分子生物学常用技术 823

附录3A 放射自显影 823

附录3B 玻璃器皿的硅化 825

附录3C 透析与超滤 826

附录3D 用吸收光谱法和荧光光谱法定量DNA和RNA 831

附录3E 通过沉默突变引入限制性酶切位点 835

附录4 试剂和设备的供应商 838

附录5 参考文献 846

致谢 858