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第一章 基因工程药物概论 1

第一节 基因工程药物与基因治疗 1

一、基因工程药物 1

二、基因治疗 2

第二节 遗传工程 3

一、动物遗传工程 3

二、植物遗传工程 3

第三节 基因药物研究的几项前沿技术 4

一、反义技术 4

二、三螺旋DNA技术 6

三、DNA疫苗（核酸疫苗） 7

第一节 基因重组技术 8

第二章 基因药物研究的基本方法 8

一、cDNA的克隆 9

二、PCR扩增 9

第二节 重组蛋白的表达 12

第三节 蛋白质设计 15

一、蛋白质变异 16

二、蛋白质嵌合物 16

第四节 基因工程技术在药物研究中的应用 17

一、细胞膜受体作为药物研究的靶点 17

二、抗原表型显示文库 18

三、转基因动物 18

四、基因治疗 20

五、基因工程产品 21

一、命名和分类 23

第三章 基因工程中常用的酶 23

第一节 限制性核酸内切酶 23

二、Ⅱ类限制酶 24

第二节 DNA连接酶 28

第三节 DNA聚合酶 29

一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 29

二、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段(Klenow酶） 29

三、T4 DNA聚合酶 31

四、T7 DNA聚合酶 32

五、测序酶 32

六、逆转录酶 32

七、Taq DNA聚合酶 33

一、碱性磷酸酶 34

八、末端转移酶 34

第四节 核酸修饰酶 34

二、T4多核苷酸激酶 35

第五节 其他酶 35

一、BAL 31核酸酶 35

二、S1核酸酶 36

三、绿豆核酸酶 36

四、核糖核酸酶 36

五、脱氧核糖核酸酶Ⅰ 36

六、核酸外切酶 36

二、典型的PCR操作 38

一、原理 38

第一节 概述 38

第四章 聚合酶链反应 38

第二节 反应条件 39

一、缓冲液 39

二、模板核酸 39

三、引物 40

四、底物(dNTP） 40

五、酶 40

六、反应条件的选择 40

第三节 引物的设计 41

第四节 耐热DNA聚合酶 41

第五节 污染的控制 42

一、预防 42

三、处理 43

二、污染源的追踪 43

第六节 标本的制备 44

第七节 PCR技术的新进展 45

一、反向 PCR 45

二、一步法扩增 45

三、标记引物PCR 45

四、定量PCR 46

五、PCR固相分析法 46

六、DNA单链构象多态性的PCR检测技术 47

七、免疫PCR 47

十一、多重PCR 48

十、差异展示PCR 48

九、不对称PCR 48

八、锚定PCR 48

十二、着色互补PCR 49

十三、碱基替代PCR 49

十四、单一特异引物PCR 49

十五、臆断引物PCR 49

十六、cDNA末端的快速扩增 49

第八节 应用 50

一、遗传性疾病的基因诊断 50

二、检测病毒 50

三、检测癌基因 50

六、其他 51

五、性别鉴定 51

四、法医学中的应用 51

第五章 基因文库的构建 53

第一节 基因组文库 53

一、载体 54

二、外源DNA片段 57

三、连接和包装 58

四、保存和扩增 58

五、基因组文库的调用 59

第二节 cDNA文库的构建 59

一、mRNA的分离 59

二、cDNA第一链的合成 62

四、载体 63

三、cDNA第二链的合成 63

五、cDNA的克隆 64

六、λ噬菌体文库的扩增 66

第六章 定点突变 67

第一节 基本原理 67

一、概述 67

二、操作程序 68

第二节 方法 69

一、盒式诱变 70

二、寡核苷酸引物诱变 70

三、PCR诱变 73

第三节 应用 75

第七章 基因的克隆与测序 78

第一节 目的基因的克隆 78

一、材料的选择 78

二、DNA片段的制备及克隆 78

三、目的基因与载体的连接 80

四、目的基因的转入 83

五、重组体的筛选 86

第二节 基因测序 88

一、Sanger测序法 88

二、化学降解法 89

三、基因测序的策略 90

四、DNA自动测序 91

第三节 克隆基因的新方法 92

一、外元捕捉法 93

二、外元扩增法 93

三、编码序列富集法 94

四、岛屿获救PCR法 94

五、核不均一RNA法 94

六、消减杂交法和差别显示法 95

七、动物园杂交法 96

第四节 实验方法的改进 96

第八章 表达载体的构建 98

第一节 原核表达载体的构建 98

一、调控元件 98

二、融合蛋白型表达载体 99

三、非融合型表达载体 100

四、分泌型表达载体 101

五、其他表达载体 102

第二节 哺乳动物表达载体的构建 103

一、功能元件 103

二、筛选标记 104

三、真核病毒序列 105

四、报告基因 107

五、其他表达系统 108

第九章 真核基因在原核生物中的表达及调控 110

第一节 概述 110

一、大肠杆菌表达系统的特点 110

二、表达真核基因的条件 110

一、启动子 111

第二节 表达载体的构建 111

二、转录终止子 113

三、核糖体结合位点 114

第三节 真核基因在大肠杆菌中的表达形式 115

一、胞内表达 115

二、蛋白分泌型表达 117

第四节 表达的调控 118

一、DNA水平的调控 118

二、转录水平的调控 118

三、翻译水平的调控 118

第五节 表达蛋白的提取和纯化 120

一、提取 120

五、影响表达的其他因素 120

四、翻译后水平的调控 120

二、纯化 121

三、检测 121

第十章 目的基因在真核生物中的表达与调控 123

第一节 真核生物中的表达与调控 123

一、转录前的基因调控 124

二、转录水平的调控 125

三、转录后水平的调控 128

四、翻译水平的调控 128

五、翻译后水平的调控 129

六、内含子对基因表达的调控 129

一、酵母表达系统 130

第二节 真核生物表达系统 130

二、昆虫细胞表达系统 131

三、哺乳动物细胞表达系统 131

第十一章 蛋白产物的分离纯化 135

第一节 步骤 135

一、细胞的破碎 135

二、溶剂萃取 137

三、离心 138

四、析出 140

五、柱层析 142

六、膜分离 146

第二节 分离路线 148

第三节 应用 148

七、蛋白的复性 148

第十二章 干扰素 151

第一节 概述 151

一、序列结构 151

二、分类 151

三、生物学活性 153

四、传统方法生产干扰素 153

第二节 基因工程生产干扰素 153

一、克隆及基因文库的构建 153

二、基因文库的调用 155

三、表达方法 156

四、提取、纯化及鉴定 161

五、活性检测 161

一、临床治疗方面 162

第三节 应用 162

六、新型干扰素 162

二、基础研究方面 163

第十三章 白细胞介素 165

第一节 概述 165

第二节 IL-2 167

一、基因结构 167

二、蛋白质结构和理化性质 167

三、IL-2基因的转录、激活及调控 168

四、制备 169

六、生物学活性 172

七、应用 172

五、检测 172

第三节 IL-4 173

一、基因结构 173

二、蛋白质结构和理化性质 174

三、制备 174

四、检测 175

五、生物学活性 175

六、应用 175

第四节 IL-6 175

一、基因结构 175

五、生物学活性 176

四、检测 176

三、制备 176

二、蛋白质结构和理化性质 176

六、应用 177

第五节 IL-4受体 177

一、基因结构 177

二、蛋白质结构 178

三、制备 178

四、检测 179

五、生物学活性 179

六、应用 179

一、基因和分子结构 181

第一节 概述 181

第十四章 促红细胞生成素 181

二、来源及性质 182

第二节 基因工程生产EPO 183

一、基因克隆 183

二、蛋白表达 183

三、活性测定 185

第三节 EPO受体 185

一、基因结构 185

二、空间结构及功能部位 186

三、信息传递 186

四、骨髓增生异常综合征性贫血 187

三、结缔组织性贫血 187

五、难治性贫血 187

二、癌性贫血 187

一、肾性贫血 187

第四节 应用 187

六、减少外科手术输血量 188

第十五章 组织型纤溶酶原激活剂 189

第一节 概述 190

一、基因结构 190

二、氨基酸特征 192

三、理化性质及生物学活性 192

第二节 基因工程生产t-PA 194

一、基因克隆 194

二、蛋白质工程 194

三、生产工艺 195

四、基因治疗 196

五、检测 197

第三节 应用 197

第十六章 粒／巨噬细胞集落刺激因子 199

第一节 概述 199

一、基因结构 199

二、蛋白质结构 199

三、生物学活性 200

第二节 基因工程生产GM-CSF 201

一、基因文库的构建及克隆 202

二、表达 202

三、纯化 204

四、生产技术的改进 206

二、艾滋病 207

第三节 应用 207

一、肿瘤化疗所致的造血障碍 207

三、骨髓异常增生综合征(MDS)和再生障碍性贫血 208

四、骨髓移植 208

五、增强免疫功能 208

第十七章 粒系集落刺激因子 210

第一节 概述 210

一、基因结构 210

二、蛋白质结构 211

三、生物学活性 212

第二节 基因工程生产G-CSF 213

一、基因文库的构建及克隆 213

二、表达 214

三、纯化 215

四、生产技术的改进 216

第三节 应用 218

一、中性粒细胞减少症 218

二、白血病 218

三、外周造血干细胞移植 218

第十八章 基因工程抗体 221

第一节 概述 221

一、产生及分类 221

二、结构 221

三、基因定位 221

四、功能 222

第二节 基因工程生产抗体 223

一、基因文库的构建 223

二、嵌合抗体的制备 225

三、双特异性抗体的制备 227

四、生产技术的改进 232

五、纯化 233

六、检测 234

第三节 应用 234

一、诊断和治疗方面 234

二、研究方面 235

第十九章 基因工程疫苗 237

第一节 概述 237

一、保护性表位的筛选及鉴定 237

第二节 乙肝疫苗 238

一、酵母表达系统 238

二、特定编码基因的克隆及表达 238

二、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达系统 240

三、重组病毒疫苗 241

第三节 肿瘤疫苗 242

一、肿瘤的识别与排斥 242

二、分类 242

三、导入肿瘤细胞的目的基因 242

第四节 血吸虫疫苗 243

一、GST的筛选过程 244

二、相对分子量为62 000的肌球蛋白分子重链 244

三、相对分子量为40 000的原肌球蛋白 244

第五节 疟疾疫苗 244

三、富含丝氨酸蛋白重复抗原(SERA） 245

二、环子孢子蛋白 245

一、裂殖子表面蛋白 245

第六节 核酸疫苗 246

一、研究进程 246

二、疫苗的构建 247

三、接种方式、途径及对免疫效果的影响 247

四、免疫效果的检测 248

五、免疫应答反应 248

六、作用机制 249

七、应用前景 250

一、基本原理 252

二、特点 252

第一节 概述 252

第二十章 基因诊断 252

三、临床意义 253

四、技术和方法 253

第二节 核酸分子杂交 254

一、基因探针 254

二、杂交方法 258

三、杂交信号检测 260

第三节 PCR技术 261

一、原理及发展 261

二、原位PCR技术 262

三、定量PCR技术 264

四、PCR扩增产物的检测 265

一、限制性酶切图谱直接分析法 266

第四节 限制性片段长度多态性分析 266

二、RFLP间接分析法 267

第五节 扩增核酸和探针信号的几项新技术 267

一、连接酶链反应 268

二、Qβ复制酶系统 268

三、信号放大 269

第二十一章 基因治疗 270

第一节 概述 270

一、分类 270

二、治疗方式 270

三、治疗途径 271

第二节 病毒载体基因转移技术 271

一、逆转录病毒载体 271

二、腺病毒载体 273

三、腺病毒相关病毒载体 274

四、痘苗病毒载体 274

五、单纯疱疹病毒载体 274

六、人工染色体 275

第三节 非病毒介导的基因转移技术 275

一、非病毒转移法 275

二、病毒增强转移法 276

第四节 基因治疗的靶向问题 277

一、目的基因表达空间的定位 277

二、目的基因表达时序的调控 280

三、目的基因表达水平的调控 281

二、肿瘤 282

第五节 基因治疗的应用 282

一、遗传病 282

三、病毒性感染 284

第六节 前景和存在的问题 284

第二十二章 转基因动物和克隆动物 286

第一节 转基因动物生物反应器 286

一、由“巨鼠”到转基因动物系统 287

二、研究概况 287

三、研制转基因动物的方法 287

四、转基因动物反应器的研制 288

五、膀胱生物反应器的研制 289

六、应用前景 289

一、一个长期引起遗传学家兴趣的问题 290

第二节 细胞周期与克隆动物 290

二、细胞周期 291

三、Wilmut的核转移方法 291

四、动物克隆的一些基本方法 292

五、发展前景 296

第三节 基因剔除与特异基因的导入 296

一、基因剔除 296

二、特异基因的导入 298

三、Cre-LoxP系统 298

四、应用 298

附录一 新生物制品审批办法 302

附录二 载体系统 306