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第一章　生物大分子制备和分析常用技术 1

第一节 概论 1

一、预处理和细胞的分离 1

（一）选择材料及预处理 1

（二）细胞的分离 2

二、细胞的破碎及细胞器的分离 3

第二节 电泳技术 5

一、基本原理 6

二、影响电泳的因素 7

三、醋酸纤维素薄膜电泳 8

四、琼脂糖凝胶电泳 9

（一）核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系 9

（二）核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 9

（三）琼脂糖凝胶电泳基本方法 10

五、常规聚丙烯酰胺凝胶电泳 10

（一）聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及相关特性 11

（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 12

（三）操作方法 13

六、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 14

七、聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳 15

八、聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳 16

（一）等电聚焦的原理 17

（二）pH梯度的形成 17

九、双向凝胶电泳 18

十、染色方法 19

（一）蛋白质染色 19

（二）核酸染色 20

第三节 色谱技术 21

一、色谱技术的概念 21

二、色谱法的分类 21

（一）按两相所处的状态分类 21

（二）按色谱的分离机制分类 22

三、常用的色谱方法 23

（一）凝胶色谱 23

（二）离子交换色谱 24

（三）亲和色谱 26

（四）高效液相色谱 27

（五）毛细管电泳 28

第四节 离心技术 31

一、离心理论 32

（一）离心分离的原理 32

（二）相对离心力和离心时间 33

（三）离心机的分类 35

二、离心分离的种类 35

（一）差速离心法 36

（二）密度梯度离心法 36

三、离心操作注意事项 37

第五节 分光光度技术 38

一、基本原理——朗伯-比尔定律 38

二、分光光度技术的应用 39

（一）定量分析 39

（二）定性分析 40

第二章　蛋白质、核酸的提取与分离 42

第一节 蛋白质的提取、分离纯化及定量 42

一、蛋白质（包括酶）的提取 42

（一）水溶液提取法 42

（二）有机溶剂提取法 43

二、蛋白质的分离纯化 43

（一）根据蛋白质溶解度不同进行分离的方法 44

（二）利用色谱技术对蛋白质进行分离纯化 45

（三）利用电泳技术对蛋白质进行纯化分离 48

（四）利用超速离心分离制备蛋白质 48

（五）膜分离技术在蛋白质分离纯化中的应用 49

（六）重组蛋白的分离纯化 50

（七）分离制备蛋白质的一个实例 52

三、蛋白质的定量 55

第二节 DNA的提取与分离 57

一、质粒DNA的提取与分离 57

（一）质粒提取的一般步骤 57

（二）质粒DNA的小量制备 58

（三）质粒DNA的大量制备 59

二、染色体DNA的提取与分离 61

（一）从培养细胞中提取DNA 61

（二）从组织中提取DNA 62

（三）从大量血样的白细胞中分离高分子量DNA 62

（四）从小量血样的白细胞中分离高分子量DNA 63

（五）高分子量DNA的小量快速制备 63

第三节 RNA的提取与分离 63

一、组织培养细胞胞质RNA的制备 64

二、胍盐法制备总RNA 66

（一）氯化铯纯化培养细胞的RNA 66

（二）氯化铯纯化组织中的RNA 67

（三）一步法从培养细胞或组织中分离RNA 68

三、细菌RNA的制备 69

（一）从革兰阴性菌中分离高质量RNA 69

（二）革兰阳性菌RNA的分离 71

（三）革兰阴性菌RNA的快速分离 71

四、poly（A）+RNA的制备 72

第四节 核酸的定量测定 73

一、紫外分光光度法测定DNA和RNA的含量 73

二、电泳比较法（溴化乙锭荧光法） 74

三、定磷法测定核酸 74

四、二苯胺法测定DNA含量 75

五、地衣酚法测定RNA含量 75

第三章　PCR技术 77

第一节 PCR技术基础 77

一、基本原理 77

（一）反应过程 77

（二）产物类型 78

（三）平台效应 78

二、PCR技术的特点 79

三、标准PCR反应 79

四、影响因素 80

（一）模板 80

（二）引物 81

（三）循环参数 82

（四）Taq DNA聚合酶及其浓度 83

（五）Mg2+浓度 83

（六）dNTP浓度 83

（七）其他辅助试剂 84

五、扩增产物的检测分析 84

（一）琼脂糖凝胶电泳 84

（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳 85

（三）核酸探针杂交鉴定法 85

（四）限制性内切酶分析法 85

（五）单链构型多态性分析法 86

六、PCR条件优化 86

（一）常规的优化方法 86

（二）降落PCR 86

七、PCR常见问题与对策 87

（一）PCR污染 87

（二）污染的预防 87

（三）实验中的对照 87

（四）扩增反应总是阴性结果（无产物）时应采取的措施 87

（五）出现非特异性产物时应采取的措施 88

第二节　PCR技术的扩展 88

一、逆转录PCR 88

二、定量PCR 89

（一）利用参照物的定量方法 89

（二）竞争性定量PCR 89

（三）荧光定量PCR 90

三、重组PCR 91

四、反向PCR 92

五、不对称PCR 92

六、复合PCR 92

七、着色互补PCR 93

八、锚定PCR 93

九、原位PCR 93

十、膜结合PCR 93

十一、固着PCR 93

十二、增效PCR 94

第三节　PCR技术的应用 94

一、PCR技术在分子生物学中的应用 94

二、PCR技术在传染病病原体检测中的应用 95

三、PCR在肿瘤相关基因检测中的应用 96

四、PCR技术在遗传病早期诊断中的应用 97

五、PCR在骨髓移植HLA-D位点配型中的应用 98

六、PCR技术在法医学鉴定中的应用 98

七、PCR在进化分析中的应用 99

第四章　分子杂交与印迹技术 100

第一节 核酸杂交的基本理论 100

一、DNA变性、复性及杂交 100

二、核酸探针 101

三、核酸杂交方法 102

（一）影响杂交的因素 102

（二）固相杂交法 103

（三）液相杂交法 104

（四）杂交信号的检测 107

第二节 常用印迹杂交方法 107

一、Southern印迹杂交法 107

二、Northern印迹杂交法 111

三、斑点及狭缝印迹杂交 113

四、菌落原位杂交法 113

五、核酸原位杂交法 115

（一）组织与细胞的固定 115

（二）载片和组织切片的处理 115

（三）杂交 116

（四）杂交后处理 118

（五）显示 119

（六）对照实验和核酸原位杂交结果的判断 119

六、Western印迹杂交法 120

（一）蛋白质的分离 120

（二）转膜 120

（三）鉴定用膜的准备 121

（四）鉴定 122

第五章　分子克隆技术 123

第一节 概述 123

一、分子克隆的基本步骤 123

二、分子克隆研究的内容 124

（一）分子克隆工具的研究 124

（二）分子克隆技术的研究 124

（三）克隆对象——目的基因的研究 124

（四）分子克隆产品的研究 124

第二节 克隆操作中需要的工具酶 125

一、限制性核酸内切酶 125

（一）限制性核酸内切酶的类别 126

（二）同工异源酶与同尾酶 127

（三）限制性核酸内切酶活性及其影响因素 128

二、DNA连接酶 128

三、DNA聚合酶 129

（一）DNA聚合酶Ⅰ 129

（二）Klenow酶 129

（三）Taq DNA聚合酶 129

（四）逆转录酶 130

（五）T4 DNA聚合酶 130

（六）T7 DNA聚合酶 131

四、修饰酶 131

（一）碱性磷酸酶 131

（二）末端转移酶 132

（三）T4多核苷酸激酶 132

（四）S1核酸酶 132

第三节 基因克隆载体 133

一、质粒载体 133

二、噬菌体载体 135

三、黏粒载体 137

第四节 基因克隆的一般方法 137

一、获得目的基因的常用方法 137

（一）化学合成法 137

（二）逆转录PCR克隆目的基因 138

（三）PCR方法克隆目的基因 139

（四）利用基因表达差异的克隆方法 139

二、目的基因与载体连接 141

（一）具黏性末端的DNA片段之间的连接 141

（二）平末端的连接 142

三、构建文库克隆目的基因 143

（一）构建cDNA文库克隆目的基因 143

（二）构建基因组文库克隆目的基因 147

四、利用差异文库的克隆方法 150

（一）差别杂交和扣除杂交克隆的目的基因 150

（二）代表性差别分析技术克隆目的基因 151

（三）抑制性扣除杂交技术 153

第五节 克隆筛选与鉴定 155

一、重组DNA导入受体细胞 155

二、重组体的筛选与鉴定 156

（一）根据遗传表型的筛选方法 156

（二）依赖重组子结构特征的筛选法 158

第六章　外源基因转移技术 160

第一节 外源基因导入原核细胞的常用方法 160

一、自然条件下的转化现象 160

二、受体细胞的选择 161

三、转化方法 162

（一）CaCl2诱导大肠杆菌转化法 162

（二）电穿孔驱动的完整细胞转化 164

（三）PEG介导的细菌原生质体转化 164

（四）通过接合作用传递质粒DNA 165

（五）λ噬菌体的转导和转染 165

四、转化率及其影响因素 166

第二节 外源基因导入真核细胞的方法 167

一、物理方法 168

二、化学方法 170

三、生理方法 174

第三节 病毒载体介导的基因转移 175

一、RNA病毒载体及其介导的基因转移 175

（一）逆转录病毒 175

（二）逆转录病毒载体 176

二、DNA病毒载体及其介导的基因转移 179

（一）腺病毒载体 179

（二）腺病毒相关病毒载体 180

（三）疱疹病毒载体 180

（四）嵌合（杂合）病毒载体 181

第四节 报告基因的应用 181

一、报告基因及其应用范围 181

（一）报告基因 181

（二）报告基因的应用 182

二、常见的几种报告基因及其应用 183

（一）荧光素酶 183

（二）绿色荧光蛋白 184

（三）氯霉素乙酰转移酶（CAT） 187

（四）β-半乳糖苷酶 187

（五）分泌型的碱性磷酸酶（SEAP） 188

（六）人生长激素（hGH） 188

（七）β-葡糖醛酸酶（GUS） 189

第七章　蛋白质表达技术 190

第一节 外源基因在原核细胞中的表达 190

一、大肠杆菌表达系统 190

（一）大肠杆菌表达载体的表达元件 190

（二）大肠杆菌的表达载体 194

（三）外源基因在大肠杆菌中表达 197

（四）提高外源基因表达水平的措施 199

（五）包含体 200

二、芽孢杆菌表达系统 201

（一）芽孢杆菌基因表达的特点 201

（二）芽孢杆菌表达系统 202

（三）存在的问题 203

三、链霉菌表达系统 204

（一）链霉菌的生物学特征 204

（二）链霉菌基因表达的特点 205

（三）链霉菌基因表达系统 206

（四）影响链霉菌中基因表达的因素 208

（五）链霉菌表达系统的优缺点 209

第二节 外源基因在真核细胞中的表达 209

一、酵母表达系统 209

（一）酵母表达系统的组成 210

（二）酵母表达系统的应用策略 213

二、昆虫表达系统 216

（一）杆状病毒表达系统 216

（二）家蚕核型多角体病毒（BmNPV）表达系统 220

第三节 哺乳动物细胞表达系统 220

一、哺乳动物细胞表达系统的构成 221

（一）宿主细胞 221

（二）表达载体 222

（三）目的基因 225

二、常用的细胞表达系统 225

三、基因的导入方法 226

四、外源基因在哺乳细胞的表达和基因表达产物的检测 226

五、哺乳动物细胞表达系统的改进策略 226

（一）改进表达载体，提高表达水平 226

（二）改造宿主细胞及培养手段 228

（三）提高产品质量 229

（四）筛选高表达细胞克隆的新方法 230

第四节 重组蛋白的检测与鉴定 230

一、定量分析 230

二、纯度分析 230

三、重组蛋白质的鉴定 231

第八章　分子标记技术 233

第一节　概述 233

一、放射性同位素 233

（一）放射性同位素的基本性质 233

（二）放射性强度及其度量单位 234

（三）射线与物质的相互作用 234

（四）射线的防护 234

二、放射性同位素标记 235

三、非同位素标记 236

（一）发光信号的特点 236

（二）化学发光的本质 237

（三）生物发光 237

（四）荧光的基础 237

第二节 核酸的标记 238

一、放射性同位素标记探针 238

（一）切口平移法 238

（二）末端标记法 240

（三）随机引物法标记DNA片段 243

（四）聚合酶链反应标记高活性DNA探针 244

二、非放射性同位素标记 244

（一）间接非同位素标记 245

（二）用生物素、地高辛或荧光素标记探针的方法 245

（三）DIG标记实例 248

（四）直接非同位素标记 249

第三节 蛋白质的标记 250

一、荧光标记 250

（一）利用氨基的标记方法 250

（二）利用巯基的标记方法 252

（三）利用醇羟基的标记方法 253

二、利用酶、酶的底物及酶抑制剂的标记 253

（一）糖苷酶及其底物 254

（二）磷酸酶类及其底物 254

（三）其他酶与底物 255

（四）生物素与亲和素系统 255

三、利用抗体的标记技术 256

（一）免疫荧光标记技术 256

（二）放射免疫标记技术 257

（三）酶免疫标记技术 258

（四）胶体金标记技术 258

（五）发光免疫标记技术 259

第九章　分子改造技术 261

第一节 概述 261

第二节 蛋白质的体外改造 262

一、寡核苷酸指导的诱变方法 262

（一）非PCR的诱变方法 263

（二）PCR方法 263

（三）诱变寡核苷酸的设计 265

二、随机诱变 266

（一）化学诱变 266

（二）丙氨酸扫描诱变 267

三、突变体筛选方法 267

（一）限制酶切割区分亲本模板与突变产物 268

（二）单一限制位点的消除 268

四、分子进化 268

（一）概念 268

（二）基本方法 269

第三节 蛋白质改造技术的应用 271

一、点突变 271

二、结构域改组 271

三、全蛋白的重组 272

四、蛋白质-配体相互作用 272

第四节 单克隆抗体的改造 273

一、抗体的产生和抗体的结构 274

二、多抗、单抗及重组抗体 275

三、抗体改造 276

（一）人-鼠嵌合抗体 276

（二）小分子抗体 277

（三）双功能抗体 277

（四）抗体融合蛋白 278

第十章　测序及人工合成技术 279

第一节 DNA序列测定 279

一、Sanger双脱氧链终止法 279

（一）Sanger双脱氧链终止法的原理 279

（二）Sanger双脱氧链终止法所需关键试剂 280

（三）用于测序的变性凝胶电泳 282

（四）大片段DNA的测序策略 282

二、Maxam-Gilbert化学修饰法 283

（一）化学裂解法测序的原理 283

（二）化学试剂特异断裂DNA的机制 284

三、DNA序列的自动测序 284

第二节　DNA的化学合成 285

一、DNA化学合成的原理 286

（一）磷酸三酯法合成寡核苷酸的原理 286

（二）固相亚磷酸三酯法合成寡核苷酸的原理 286

（三）用寡核苷酸片段组装基因的方式 288

二、DNA合成技术在分子生物学研究中的应用 289

第三节 蛋白质和多肽的氨基酸序列测定 291

一、序列测定前的准备 291

（一）蛋白质纯化 291

（二）肽链的分离 292

（三）肽链的部分裂解 292

（四）肽片段的分离 293

二、序列测定的方法和原理 294

（一）手工测序 294

（二）自动序列分析 297

三、影响测序的因素 298

第四节 蛋白质或多肽的化学合成 298

一、氨基酸官能团的保护 299

二、羧基的活化和肽键的生成 301

三、合成肽的脱保护基及纯化 302

第十一章　基因组学技术 305

第一节 结构基因组学及常用研究技术 305

一、基因组作图 305

二、新基因的分离——cDNA末端快速扩增（RACE）技术 307

三、基因组序列测定技术 310

四、基因定位技术 311

（一）荧光原位杂交（FISH）技术 311

（二）辐射杂种细胞系（RH）技术 312

第二节 功能基因组学及常用研究技术 312

一、基因突变检测（分析）技术 313

（一）单链构象多态性（SSCP）技术 313

（二）变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术 315

（三）直接测序法 317

（四）单碱基延伸标签阵列技术（SBE-TAGS） 318

（五）异源双链分析技术 318

（六）连接酶链反应 318

（七）等位基因特异性寡核苷酸杂交（ASOH） 318

（八）RNA酶A切割法 319

（九）基于PCR与酶切的技术 319

（十）高通量检测技术 320

二、比较基因组杂交技术 321

三、微阵列-比较基因组杂交技术 323

四、染色体原位杂交 325

五、基因表达分析技术 325

（一）基因表达系列分析技术（SAGE） 326

（二）RNase保护试验（RPA） 328

六、模式生物体研究 328

（一）转基因动物 329

（二）基因打靶技术 334

（三）时空可调节性基因打靶技术 337

（四）基因陷阱 338

（五）诱变技术在功能基因组学中的应用 341

七、SNP、EST在研究新（未知）基因中的应用 341

（一）单核苷酸多态性（SNP） 341

（二）表达序列标签（EST） 343

第十二章　蛋白质组学技术 345

第一节 概述 345

一、蛋白质组学研究的意义和背景 345

二、蛋白质组学研究的特点 346

第二节 蛋白质组学研究的技术体系与路线 350

一、蛋白质组分离技术 350

（一）双向凝胶电泳的特点 350

（二）双向凝胶电泳的基本步骤 351

（三）蛋白质组分离的非凝胶技术 356

二、蛋白质组分析技术 358

三、蛋白质组数据库的建立和生物信息学 359

四、蛋白质组研究的发展趋势及应用前景 359

第三节 蛋白质组学技术平台与完整解决方案 360

一、蛋白质组学技术平台 360

二、蛋白质组学研究的完整解决方案 361

第十三章　生物芯片技术 364

第一节 概述 364

一、生物芯片的概念和特点 364

二、生物芯片的分类 365

第二节 基因芯片 366

一、基本原理 366

二、基因芯片的制备和检测 366

（一）芯片载体的表面修饰 366

（二）芯片阵列制作方式 367

（三）杂交探针的种类与制备 368

（四）样品制备和标记 370

（五）杂交 370

（六）杂交信号采集和处理 371

（七）生物信息的分析和提取 371

第三节 蛋白质芯片 373

一、基本原理 374

二、蛋白质芯片制备和检测的基本流程 377

（一）蛋白质芯片制备与检测流程 377

（二）待检样品的制备和标记 379

（三）蛋白质芯片的杂交反应和结果检测 380

三、蛋白质芯片的研究进展 381

（一）方法学研究和新技术的应用 381

（二）抗体芯片 382

第四节 生物芯片在医学中的应用 382

一、基因芯片在医学中的应用 382

（一）微缩实验室芯片 382

（二）基因突变分析 383

（三）克隆选择及文库筛选 383

（四）测序芯片 384

（五）基因多态性分析 384

（六）基因表达谱分析 384

（七）微生物菌种鉴定、致病机理及耐药性分析 385

（八）药物筛选芯片 385

二、蛋白质芯片在医学中的应用 385

（一）蛋白质组-基因组链接 385

（二）高通量的蛋白质表达筛选及药物研究 386

（三）蛋白质和蛋白质之间相互作用的研究 386

（四）在疾病诊断方面的应用 388

（五）展望 388

第十四章　生物信息学技术 390

第一节 概述 390

一、生物信息学的诞生和发展 390

二、生物信息学研究的基本方法 390

三、生物信息学的目的意义 391

第二节 常用核酸序列数据库 392

第三节 常用蛋白质序列数据库 398

第四节 序列分析 402

一、序列比对方法和相似性搜索 403

二、FASTA 404

三、BLAST 405

第五节 蛋白质结构预测 410

一、二级结构和折叠类型 410

二、三级结构预测 411

第十五章　RNA研究技术 414

第一节 RNA结构分析和合成分析 414

一、用单链DNA探针和S1核酸酶分析mRNA 414

二、核糖核酸酶保护测定 419

三、引物延伸法 422

四、RNA run-on分析 424

第二节 RNA组学技术 425

一、反义核酸技术 426

（一）反义RNA作用机制 426

（二）反义RNA技术方法 427

（三）反义RNA技术应用 428

二、RNA干扰（RNAi）技术 428

（一）RNAi作用的机制 429

（二）RNAi实验方案 430

（三）RNAi敏感性的预测 432

（四）siRNA导入宿主细胞 433

（五）结果分析 434

（六）RNAi在基因功能分析中的应用 434

第三节 核酶技术 434

第四节 RNA错折叠（ODMiR）技术 436

附录 438

参考文献 451