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目录 1

理论 1

第一章抗体的结构与功能 1

一、抗体是能与相应抗原以高亲合力结合的有用试剂 2

二、血清中含有能与抗原不同表位结合的混合抗体 2

第二章抗体－抗原反应 2

三、抗体的结构由抗原结合区和细胞结合区组成 3

四、IgG由2条相同的多肽重链和2条相同的多肽轻链组成 5

五、血清中除IgG分子外还有其他类型的抗体分子 5

八、重链和轻链的可变区形成抗原结合部位 6

七、含有一个可变区和一个恒定区的重链一级氨基酸序列 6

六、含有一个可变区和一个恒定区的轻链一级氨基酸序列 6

九、抗原结合部位多样性的多基因机制 7

十、进一步重组产生不同类和亚类的抗体 8

十一、可变区提供抗原结合位点和特异性，恒定区决定抗体如何发挥作用 8

第一节抗体－抗原复合物的结构 18

一、抗体的抗原结合位点由重链和轻链的可变区构成 18

二、抗原与抗体的结合区称为表位 19

三、蛋白质抗原上的表位是由相邻连续的或非连续的氨基酸序列形成的局部表面结构 19

四、某些免疫复合物中抗体或抗原的结构未发生改变，而另一些则出现巨大的构象改变 20

五、抗体－抗原复合物通过大量非共价键连接 20

一、抗体和抗原的结合是可逆的，相互作用的强度可以描述为平衡反应 21

二、抗体－抗原之间相互作用的亲和力有很大的差异 21

第二节亲和力 21

六、抗体能与范围广泛的化学结构发生结合并能区分类似的化合物 21

三、在特定的环境中抗体－抗原的亲和力虽然不能改变，但可以控制免疫复合物的形成量 22

第三节亲合性 22

一、当抗体和抗原形成多价复合物时相互作用的强度显著增加 22

二、同聚体的抗原存在相同的重复表位，促进双价结合 24

三、和抗原上的多个位点结合的抗体能够形成大而稳定的多聚复合物 24

四、和抗原上多个位点结合的抗体为第二试剂提供大量极好的靶分子 25

五、固定在固相支持物上的抗原在高浓度时能促进高亲合性的双价结合 25

第三章抗体的选择 31

第一节免疫化学技术成功的要素 31

一、抗体－抗原的亲合性 31

二、抗体的特异性 32

三、表位破坏 33

四、抗体的易接近性 34

五、二级试剂 36

第二节合适抗体的选择 36

一、不同免疫化学方法的比较 37

二、最佳抗体选择方法的比较 39

三、多克隆抗体、单克隆抗体或混合单克隆抗体的应用 41

第三节最佳二级试剂的选择 41

一、二级试剂产生的背景 41

二、商业来源试剂的灵敏度 41

三、商业来源试剂的滴度 42

四、特异性 42

第四节索取抗体的环节 42

二、储存温度 45

一、污染 45

第四章抗体的处理 45

第一节抗体的储存 45

三、储存时间 46

第二节抗体的纯化 48

一、推荐使用的纯化方法 49

二、纯化抗体的定性和定量 49

第三节抗体的标记 55

一、直接法与间接法 55

二、标记物的选择 56

第四节经蛋白A或蛋白G纯化抗体的方法（小结） 64

第五章细胞染色 67

第一节免疫染色法的主要影响因素 67

实践 67

第二节合适抗体的选择 68

一、标本的固定 68

二、可能的交叉反应 69

三、应用单克隆抗体、多克隆抗体进行细胞染色 71

第三节组织培养细胞免疫染色的方法 72

一、免疫染色方法的概述 72

二、细胞标本的制备 72

三、固定 76

四、抗体的结合及检测 79

第四节免疫染色技术的特殊问题 87

一、双标记染色法 88

二、免疫染色技术与放射自显影技术的联合使用 88

五、应用免疫染色进行定量检测 89

四、应用免疫染色进行细胞分选 89

三、细胞表面蛋白的染色 89

六、生物素和链霉亲合素 90

第五节对盖玻片上生长的细胞进行染色（小结） 90

一、特点 90

二、操作步骤 91

第六章组织免疫染色 94

第一节主要影响因素 94

第二节合适抗体的选择 95

一、抗原特异性 95

二、固定 96

三、组织灌流 96

第三节应用单克隆抗体或多克隆抗体进行组织免疫染色 96

三、应用混合单克隆抗体进行组织免疫染色 97

一、应用多克隆抗体进行细胞免疫染色 97

二、应用单克隆抗体进行组织免疫染色 97

第四节组织切片的免疫染色方法 98

一、组织切片免疫染色过程 98

二、组织标本的制备 98

三、结合 102

四、检测 104

第五节酵母菌免疫染色的特殊性 110

第六节美丽线虫免疫染色的特殊性 113

一、Bouin固定虫体法 114

二、多聚甲醛固定虫体法 115

三、虫体的抗体染色和检测 116

二、发育早期胚胎的制备 118

一、方法概述 118

第七节果蝇类免疫染色的特殊性 118

三、发育晚期胚胎的制备 119

四、在果蝇类标本内加入抗体及酶标试剂染色检测 120

第八节抗原修复方案 125

一、蛋白酶处理以暴露被掩盖的抗原表位 125

二、微波处理以暴露被掩盖的抗原表位 126

三、加压蒸煮处理以暴露被掩盖的抗原表位 126

第九节冷冻组织切片（小结） 127

第七章免疫沉淀 131

第一节主要影响因素 131

第二节合适抗体的选择 132

一、应用多克隆抗体进行免疫沉淀 132

二、应用单克隆抗体进行免疫沉淀 133

三、应用混合单克隆抗体进行免疫沉淀 134

第三节免疫沉淀技术 134

一、免疫沉淀技术概述 134

二、裂解细胞 136

三、裂解物的预处理 142

四、免疫复合物的纯化 143

第四节免疫沉淀技术的特殊问题 147

一、蛋白质相对分子质量的确定 148

二、蛋白质的稳态水平 149

三、蛋白质抗原半寿期的测定 150

四、蛋白质翻译后修饰的测定 152

五、蛋白质－蛋白质间的相互作用 154

七、抗原裂解物的清除 156

六、蛋白质内在或相关酶活性的测定 156

第五节免疫沉淀（小结） 157

第八章免疫印迹 161

第一节主要影响因素 161

第二节合适抗体的选择 161

一、变性蛋白的识别 161

二、非特异性条带 162

三、多克隆抗体或单克隆抗体的免疫印迹 163

四、检测范围 164

第三节免疫印迹技术 165

一、免疫印迹技术概述 165

二、样品的制备 165

四、蛋白质从凝胶转印至膜 169

三、凝胶电泳 169

五、印迹膜上总蛋白的染色 175

六、抗原检测 177

第四节检测中的特殊问题 182

一、特殊问题1——精确定量 182

二、特殊问题2——设置对照 182

三、特殊问题3——用生物素／链霉亲合素检测多种属来源抗体 183

第五节免疫印迹技术的特殊问题 183

一、免疫印迹检测酪氨酸残基的磷酸化 183

二、剥离与重复免疫印迹 183

三、免疫印迹纯化抗体 184

第六节免疫印迹（小结） 184

第一节主要影响因素 188

第九章免疫亲和纯化技术 188

第二节合适抗体的选择 189

第三节应用多克隆抗体和单克隆抗体进行免疫亲和纯化 190

一、应用多克隆抗体进行免疫亲和纯化 190

二、应用单克隆抗体进行免疫亲和纯化 190

三、应用混合单克隆抗体进行免疫亲和纯化 191

第四节免疫亲和纯化技术 191

一、免疫亲和纯化技术概述 191

二、抗体亲和层析柱的制备 192

三、抗原与抗体－微珠基质的结合 197

亲和纯化抗体制备 203

第六节免疫亲和纯化（小结） 203

第五节免疫亲和纯化的特殊问题 203

第十章标记蛋白 208

第一节主要影响因素 208

第二节为何使用标记蛋白 208

第三节蛋白检测的标记物 209

一、GFP标记物 209

二、表位标记物 210

三、其他检测标记物 213

第四节蛋白纯化的标记物 215

一、GST标记物 215

二、His标记物 215

三、表位标记物 216

四、其他纯化标记物 216

一、标记蛋白的细胞和亚细胞定位检测 218

第五节合适标记物的选择 218

二、蛋白调控和相互作用的检测 219

三、蛋白的纯化 220

第六节标记物插入的位置 221

第七节制备标记蛋白 223

一、通过克隆到表达载体中进行标记 223

二、在限制性酶切位点插入合成的标记物 224

三、采用PCR技术插入表位标记物 225

四、多肽标记物的常见问题 227

第十一章表位作图 232

第一节确定表位的基本结构 232

第二节表位作图方法的选择 233

第三节竞争分析作图法 234

第四节基因片段表达作图法 237

第五节合成肽表位作图法 238

第六节系列肽的合成或购买 239

第七节生物素标记肽的检测方法 240

第八节表位作图的替代方法 241

一、噬菌体随机肽库结合位点作图法 242

二、噬菌体特异性肽库抗体结合位点作图法 242

有用资料 245

附录Ⅰ电泳 245

附录Ⅱ蛋白质技术 260

附录Ⅲ通用资料 278

附录Ⅳ注意事项 286

附录Ⅴ注册商标 294

附录Ⅵ供应商 296