植物分子生物学 实验手册PDF电子书下载

第一部分分子生物学基本技术 3

1 基因组DNA的分离，Southern印迹和杂交 3

1.1 基因组总DNA的分离 3

1.1.1 导论 3

目 录 3

1.1 2 提取程序的原理 4

1.1.3 CTAB法分离总基因组DNA 4

1.1.4 CTAB法微量分离DNA 6

1.1.5 Dellaporta,Wood和Hicks（1983）法分离总基因组DNA 7

1.1.6 从分离的细胞核中提取DNA 9

1.1.7 氯化铯密度梯度离心法纯化DNA 10

1.1.8 DNA浓度、纯度和质量的估测 11

参考文献 11

1.2.2 分离总基因组DNA 13

1.2.3 基因组DNA的限制性内切酶酶解和微型凝胶电泳检测 13

1.2 Southern印迹 13

1.2.1 导论 13

1.2.4 DNA的琼脂糖凝胶电泳及向尼龙膜的转移 16

参考文献 20

1.3 使用放射性标记的探针进行杂交 21

1.3.1 导论 21

1.3.2 标记探针 22

1.3.3 纯化探针 24

1.3.4 杂交程序 26

1.3.5 膜的探针剥离（filter stripping） 30

参考文献 31

1.4.1 导论 32

1.4.2 提取总的基因组DNA 32

1.4 Southern印迹的非同位素检测方法 32

1.4.3 DNA的限制性内切酶酶解和Southern印迹 33

1.4.4 PCR－地高辛法标记探针 33

1.4.5 杂交、洗膜和显影以及探针的去除 37

参考文献 40

2 基因组DNA的克隆及文库构建 43

2.1 PCR技术在植物分子生物学中的应用 43

2.1.1 导论 43

2.1.2 DNA扩增程序 46

2.1.3 PCR优化 48

2.1.4 克隆 49

2.1.5 PCR技术在克隆以外的其他方面的应用 53

参考文献 57

2.2.1 导论 60

2.2 质粒文库 60

2.2.2 分离DNA 61

2.2.3 基因组DNA和质粒的限制性内切酶酶解 61

2.2.4 连接入质粒载体 63

2.2.5 感受细胞的制备 64

2.2.6 转化方法 66

2.2.7 菌落分析 68

2.2.8 文库／质粒的保存 72

参考文献 72

2.3 λ基因组克隆（Lambda genomic cloning） 75

2.3.1 导论 75

2.3.2 使用置换型载体λ2001构建λ基因组文库的操作方法 78

2.3.3 λ2001文库的滴度测定 86

2.3.4 λ2001基因组文库的扩增 86

2.3.5 文库铺板进行扩增或杂交筛选 87

2.3.6 制备噬菌斑杂交用膜 87

2.3.7 阳性噬菌体的分离和高滴度贮存液的构建 88

2.3.8 杂交阳性噬菌体的DNA制备 89

参考文献 91

2.4 粘粒文库 92

2.4.1 导论 92

2.4.2 克隆策略 92

2.4.3 文库的构建 94

2.4.4 有关粘粒文库筛选和重组粘粒克隆分析的建议 99

参考文献 100

2.5 酵母人工染色体（YAC）文库 102

2.5.1 导论 102

2.5.2 植物中百万碱基级大片段DNA的制备 104

2.5.3 载体的制备 108

2.5.4 对基因组DNA进行EcoRI部分酶解以及通过 109

PFGE对EcoRI片段进行大小选择 109

2.5.5 连接和转化样品的制备 110

2.5.6 酵母原生质体转化 111

2.5.7 酵母人工染色体克隆的制备和PFGE分析 113

2.5.8 YAC文库的保存和筛选 114

参考文献 115

3RNA的提取、克隆和减法杂交 119

3.1 从植物细胞中分离和分析信使RNA以及cDNA的克隆 119

3.1.1 导论 119

3.1.2 RNA的分离 122

3.1.3 mRNA的纯化 126

3.1.4 RNA的分析 128

3.1.5 失控转录 132

3.1.6 特定mRNA的5′和3′端的作图 136

3.1.7 cDNA的合成 138

3.1.8 特异mRNA的定量（定量RT-PCR） 140

3.1.9 cDNA的克隆 143

差异显示逆转酶－聚合酶链式反应（DDRT-PCR） 148

3.1.10 一种克隆差异表达的cDNA的新方法： 148

参考文献 153

3.2 不同mRNA的减法杂交 157

3.2.1 引言 157

3.2.2 RNA的制备 158

3.2.3 加尾的第一链cDNA的合成 158

3.2.4 代表性cDNA库的扩增 160

3.2.5 杂交 162

3.2.6 减法 163

3.2.7 再扩增 164

3.2.8 进一步杂交／减法循环 164

3.2.9 相减后的cDNA分析 164

3.2.10 克隆构建减法文库 169

参考文献 171

3.2.11 结论 171

4 克隆的鉴定 174

4.1 DNA测序 174

4.1.1 引言 174

4.1.2 嵌套不定向缺失产物的生成 178

4.1.3 质粒DNA的测序 185

参考文献 198

4.2 克隆基因的表达 200

4.2.1 导论 200

4.2.2 载体构建和蛋白表达 201

4.2.3 蛋白纯化 203

4.2.4 Westem印迹 208

参考文献 211

5 细胞器DNA的分离 217

5.1 导论 217

第二部分植物DNA的鉴定 217

5.2 叶绿体和线粒体DNA的分离 222

5.2.1 叶绿体DNA的分离 222

5.2.2 线粒体DNA的分离 225

参考文献 229

6 RAPD分析：基因组的鉴定、特征标记及作图 236

6.1 导论 236

6.2 遗传指纹作图 237

6.2.1 方法 238

6.2.2 遗传关系分析 242

6.3 遗传连锁图谱的建立 244

6.3.1 总体作图策略 244

6.3.2 有目标的方法 245

6.4 应用前景 251

参考文献 252

7 植物核基因组RFLP作图： 259

实验设计，连锁图的建立和QTL作图 259

7.1 导论 259

7.2 实验设计 261

7.2.1 纯合性与杂合性亲本 261

7.2.2 选择一个分离群体 262

7.3 RFLP探针的产生与选择 265

7.3.1 cDNA探针 265

7.3.2 基因组DNA探针 265

7.3.3 从其他作图群体中获得探针 265

7.4 RELP分析的实验室程序 266

7.5 连锁图谱的构建 266

7.5.1 单位点分离分析 267

7.5.2 检测位点间的连锁 269

7.5.3 重组频率和图距的估测 274

7.5.4 组建连锁群 276

7.5.5 位点排序 276

7.5.6 图谱构建时对偏离一般假设的敏感性 278

7.6 数量性状位点作图 280

7.6.1 标记组的方差分析 281

7.6.2 区间作图法 285

7.6.3 多个QTL方法 290

7.6.4 上位性 291

7.6.5 多效性作用 292

7.7 总结 292

参考文献 293

第三部分基因工程——方法和分析 305

8 植物基因转化 305

8.1 导论 305

8.2 农杆菌介导的基因转化 307

8.2.1 通过根瘤农杆菌转化烟草 308

8.2.2 通过根瘤农杆菌转化番茄 310

8.3 直接基因转化 312

8.3.1 水稻原生质体的直接基因转化 312

8.3.2 基因枪法 316

8.4 原生质体融合 319

8.4.1 化学融合 320

8.4.2 电融合 321

参考文献 323

9 转基因植物的分子生物学鉴定 326

9.1 导论 326

9.2 选择性标记基因 326

9.3 转化体的分子鉴定 329

9.3.1 对Southern分析的结果进行解释 329

9.4.1 gusA（β－葡糖醛酸糖苷酶基因）用作报告基因 330

9.4 报告基因的表达分析 330

9.4.2 GUS活性的组织化学定位 332

9.4.3 luc（萤火虫萤光素酶基因）作为报告基因 334

参考文献 336

10 体细胞杂种的分子鉴定 338

10.1 导论 338

10.2 体细胞杂种的一般性鉴定 339

10.3 体细胞杂种的分子鉴定 339

10.3.1 核基因组 339

10.3.2 细胞器基因组 345

参考文献 347

11 转基因植物的细胞学鉴定： 353

荧光原位杂交（FISH）定位低拷贝及重复的DNA序列 353

11.1 导论 353

11.2.3 探针类型 354

11.2.4 标记物的选择 354

11.2.1 染色体制备 354

11.2.2 高分裂中期指数 354

11.2 ISH检测低拷贝序列操作程序的优化 354

11.2.5 标记方法的选择 355

11.2.6 检测系统的选择 355

11.2.7 低拷贝信号的成像 356

11.2.8 多重标记和再杂交 356

11.3 显示荧光ISH信号 356

11.4 染色体制备 357

11.5 探针制备 357

11.5.1 从凝胶中提纯DNA 357

11.5.2 切口平移法标记DNA 357

11.6 原位杂交的操作程序 358

参考文献 368

12.1 导论 371

12 体细胞杂种的细胞学特性： 371

用基因组原位杂交（GISH）检测基因组来源 371

12.2 优化GISH条件用以区分基因组 372

12.2.1 标记方法的选择 372

12.2.2 总DNA作为探针进行原位杂交 372

12.2.3 探针的穿透性／目标的可接近性 372

12.2.4 严紧度 373

12.2.5 封闭DNA 373

12.2.6 检测系统的选择 373

12.2.7 观察和记录结果 374

12.3 细胞制备物 374

12.3.1 预处理和固定（要点1,2和7） 376

12.3.2 根尖压片制备染色体样品 377

12.3.3 酶解制备染色体样品（要点5） 377

12.3.4 减数分裂染色体的制备（要点6～8） 378

12.4 探针制备 379

12.4.1 总DNA的分离 381

12.4.2 用切口平移法进行总DNA的生物素标记（要点3,4） 381

12.4.3 用点杂交检查生物素的掺入 382

12.5 基因组原位杂交 383

12.6 显微镜技术和照相技术 386

参考文献 387

11和12 的补充具小、染色体的植物种的原位杂交 391

A.1 导论 391

A.2 用蚜栖菌素（Aphidicolin）处理获取前中期染色体 392

A.2.1 蚜栖菌素处理番茄根尖细胞同步化 393

A.2.2 染色体压片 394

A.3 原位杂交 395

参考文献 395

附录重要植物种的核基因组大小 398