医用细菌遗传学实验指南PDF电子书下载

原理篇 2

纵览 2

对多种细菌进行遗传学分析 3

0.1 开头的话 4

0.2.2 基因转移系统 5

0.2.1 诱变 5

0.2 近期目标 5

0.2.3 限制和修饰系统 6

0.3.1 自杀载体 7

0.3 中期目标 7

0.2.4 反选择 7

0.4.2 普遍性转导 8

0.4.1 物理作图 8

0.3.2 互补分析 8

0.4 远期目标 8

1.1 细菌致病机制的一般概念 9

第一章 细菌的致病机制 9

1.2.1.1 沙门氏菌属分类 13

1.2.1 鼠伤寒沙门氏菌 13

1.2 细菌致病机制各论 13

1.2.1.3 毒力机制 14

1.2.1.2 沙门氏菌感染 14

1.2.1.4 注意 15

1.2.2.1 霍乱毒素 16

1.2.2 霍乱弧菌 16

1.2.1.5 鼠伤寒沙门氏菌LT2株 16

1.2.2.3 定居因子 17

1.2.2.2 其他毒素 17

1.2.2.4 毒力因子的胞外分泌 18

1.2.2.5 毒力基因表达的调控 19

2.1.1 基因型与表现型 21

2.1 遗传学术语 21

第二章 微生物遗传学的实践方面 21

2.1.3 等位基因的编号 22

2.1.2 基因与操纵子 22

2.1.7 融合 23

2.1.6 插入 23

2.1.4 菌株的命名 23

2.1.5 缺失 23

2.1.10 基因图谱和物理学图谱 24

2.1.9 定位缺失和重复 24

2.1.8 可抑制性突变和条件性突变 24

2.2.1.2 单个菌落的纯化 25

2.2.1.1 液体培养基的接种 25

2.2 微生物学操作 25

2.2.1 基本细菌学技术 25

2.2.1.4 大量的液体培养 26

2.2.1.3 涂平板 26

2.3.1 确定成分培养基 27

2.3 培养基 27

2.2.1.5 倍数稀释 27

2.2.1.6 影印培养 27

2.3.2 复合培养基 28

2.3.4.1 四氮唑培养基 29

2.3.4 鉴别培养基 29

2.3.3 特殊复合培养基 29

2.3.3.1 Luria-Bertani肉汤 29

2.3.3.2 营养肉汤 29

2.3.5 XGal 30

2.3.4.2 麦康凯琼脂培养基 30

2.3.6 XP 31

2.3.8.2 EBU培养基 32

2.3.8.1 绿色培养基 32

2.3.7 在lac遗传学中有用的化合物 32

2.3.8 P22溶原菌的指示培养基 32

2.4.1 正选择与负选择 33

2.4 抗生素、抗生素抗性、正选择与负选择 33

2.3.9 选择性培养基 33

2.3.9.1 萎蔫酸培养基 33

2.4.3 氨基糖甙类抗生素 34

2.4.2 表现型的表达 34

2.4.4 氨苄青霉素 35

2.4.3.1 一种负选择方法 35

2.5 细菌生理学 36

2.4.7 蔗糖抗性:一种负选择方法 36

2.4.5 氯霉素 36

2.4.6 四环素 36

2.4.6.1 一种负选择方法 36

2.5.2 培养物的生长 37

2.5.1 生理学与代谢 37

2.5.2.3 监视培养物的密度 38

2.5.2.2 通气 38

2.5.2.1 培养基的选择 38

2.5.3 酶活性的测定 39

2.5.4 酶合成差率的测定 40

3.1.1 利用接合和转导技术绘制遗传图谱 42

3.1 染色体基因的遗传作图 42

第三章 遗传作图 42

3.1.2.1 物理图谱和遗传图谱的关系 43

3.1.2 物理作图 43

3.1.3 鼠伤寒沙门氏菌的Mud-P22作图 44

3.1.2.2 物理作图的实际应用 44

3.2 普遍性转导 46

3.2.1.1 P22的调节和包装 47

3.2.1 P22噬菌体 47

3.2.1.2 P22介导的普遍性转导 48

3.2.1.3 P22 HT（高频转导）突变体 49

3.2.1.4 P22的溶源性和超感染排斥 50

3.2.2 把P22的宿主范围扩展到其他细菌 52

3.2.1.5 P22介导的质粒转导 52

3.2.4 转导噬菌体的分离 53

3.2.3 PI噬菌体 53

3.3.1 根据共转导数据确定遗传连锁和基因顺序 54

3.3 利用普遍性转导技术进行遗传作图 54

3.3.2 共转导频率和物理距离之间的关系 57

3.4 缺失作图 58

3.3.4 影响遗传连锁的因素 58

3.3.3 改良的转导作图公式 58

3.4.2 定向缺失 60

3.4.1 缺失作图的实际应用 60

4.1 诱变 62

第四章 突变体及其分析 62

4.1.2 突变的类型 63

4.1.1 何为突变? 63

4.1.3.2 遗传学筛选 65

4.1.3.1 遗传学选择 65

4.1.3 突变体的分离 65

4.1.4.1 自发诱变 66

4.1.4 诱变 66

4.1.5 诱变剂 67

4.1.5.2 烷化剂 68

4.1.5.1 碱基类似物诱变剂 68

4.1.6 DNA修复 69

4.1.5.5 紫外线 69

4.1.5.3 氧化剂 69

4.1.5.4 嵌入剂 69

4.1.7 增变株 70

4.1.6.1 易错修复 70

4.1.8.2 应用核酸酶和PCR构建突变 71

4.1.8.1 定域诱变 71

4.1.8 体外诱变 71

4.1.8.3 定点诱变 72

4.1.9 随机和定向诱变 76

4.2.1 在选择性标记交换中质粒不相容性的应用 77

4.2 广宿主范围的等位基因交换系统 77

4.2.3 利用自杀载体进行非选择突变的等位基因交换 79

4.2.2 利用条件性复制子（“自杀质粒”）技术构建遗传重复和无效等位基因 79

4.3 抑制 82

4.2.4 把突变的染色体等位基因体内克隆到质粒载体上 82

4.3.2.1 信息性抑制 84

4.3.2 基因间抑制 84

4.3.1 基因内抑制 84

4.3.2.2 相互作用抑制基因 85

4.4 基因互补 86

4.3.2.5 生理性抑制 86

4.3.2.3 剂量补偿性抑制 86

4.3.2.4 旁路抑制基因 86

4.4.1 基因内互补 87

4.4.2.1 串联重复 88

4.4.2 互补方法 88

4.4.2.3 F＇附加体 90

4.4.2.2 整合性质粒 90

4.4.3 基因调控的互补分析 91

4.4.2.4 特异性转导噬菌体 91

4.5.2 无义极性 93

4.5.1 Rho依赖性的转录终止 93

4.5 极性 93

4.5.3 插入极性 95

4.5.4 极性的复杂性 96

5.1 转座子在细菌遗传学中的应用 98

第五章 转座子与融合 98

5.1.1 转座子Tn10及衍生体 99

5.1.1.1 ATS转座酶 100

5.1.1.5 Tn10启动的缺失和重排 101

5.1.1.4 调节转座酶的表达 101

5.1.1.2 缺损型mini-Tn10转座子 101

5.1.1.3 反式互补 101

5.1.3 用于笔迹标识突变的转座子 102

5.1.2 Tn5转座子 102

5.2 Mu噬菌体 103

5.2.1 Mud衍生体 104

5.2.2 瞬间顺式互补作用 105

5.2.3 作为克隆载体的Mud 106

5.3 操纵子和基因融合 107

5.2.4 在细菌遗传学中使用Mu的实践方面 107

5.3.1 lac Z的操纵子和基因融合 108

5.3.3 phoA的基因融合 109

5.3.2 uidA（gus）的操纵子和基因融合 109

5.3.4 体内表达技术 111

6.1.1 何谓毒力基因？ 114

6.1 毒力基因的调节 114

第六章 基因调控 114

6.1.3 细菌是如何调节其毒力基因的？ 115

6.1.2 细菌为什么要对毒力基因进行调节？ 115

6.1.4 为什么要研究毒力基因的调节？ 116

6.2.3 DNA-蛋白质相互作用 117

6.2.2 DNA结合位点 117

6.2 攻击噬菌体：DNA-蛋白质相互作用的遗传分析 117

6.2.1 DNA结合蛋白质 117

6.2.4 P22调节机制 118

6.2.6 攻击噬菌体的构建 119

6.2.5 攻击噬菌体 119

6.2.7 DNA结合蛋白的表达 121

6.2.8.3 DNA结合蛋白突变体的选择 123

6.2.8.2 DNA结合位点突变体的选择 123

6.2.8 攻击噬菌体的使用 123

6.2.8.1 体内DNA结合分析 123

6.2.10.1 超感染排斥 125

6.2.10 有关P22噬菌体的一些突变 125

6.2.9 范例之一：Nac蛋白质 125

6.2.10.2 arc（Am）突变 126

6.2.10.4 噬菌斑 127

6.2.10.3 基因9 127

7.1.1 质粒接合的机制 128

7.1 质粒与接合 128

第七章 重组DNA 128

7.1.2 染色体的诱动 130

7.1.5 质粒接合的应用 132

7.1.4 不相容性与遗传分析 132

7.1.3 质粒诱动转移 132

7.2.1 大肠埃希氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的转化 133

7.2 转化和电转化 133

7.2.3 电穿孔仪 134

7.2.2 电转化 134

7.3 分子生物学的基本技术 135

7.3.1 小量质粒纯化（“微量制备技术”） 136

7.3.3 酚抽提法 137

7.3.2 大量纯化质粒DNA 137

7.3.4 乙醇沉淀 138

7.3.7 双脱氧法DNA序列分析 139

7.3.6 DNA浓度推算 139

7.3.5 从DNA标本中去除污染的小分子 139

7.4.1 电流、电压和功率 142

7.4 DNA电泳 142

7.4.3 丙烯酰胺 143

7.4.2 琼脂糖 143

7.5.2 温度 144

7.5.1 对称性PCR 144

7.4.4 用溴化乙锭染色 144

7.5 聚合酶链式反应 144

7.5.4 引物 146

7.5.3 DNA聚合酶 146

7.5.8 循环数 147

7.5.7 镁 147

7.5.5 模板DNA 147

7.5.6 dNTP 147

7.5.10 PCR诱变 148

7.5.9 不对称性PCR 148

实验1～6简介 154

实验篇 154

第八章 实验1 转座子：在结构基因中插入Mini-Mu-lac 155

8.1.2 步骤 156

8.1.1 材料 156

8.1 构建Mudj的随机“跳跃” 156

8.2.2 步骤 158

8.2.1 材料 158

8.2 将Mudj插入回交到野生型菌株 158

8.4.1 材料 159

8.4 使用srl::Mudj插入构建定点缺失 159

8.3 利用Mud-P22作图确定srl：：Mudj的染色体图位 159

8.3.1 材料 159

8.3.2 步骤 159

8.4.2 步骤 160

8.5.2 步骤 161

8.5.1 材料 161

8.5 srl区域的缺失作图 161

第九章 实验2 转座子：与结构基因连锁的Tn10d插入 163

9.1.2 步骤 164

9.1.1 材料 164

9.1 构建Tn10d（Tc)的随机 跳跃” 164

9.2.1 材料 165

9.2 对srl邻近区域插入库的筛选 165

9.2.2 步骤 166

9.4.2 步骤 168

9.4.1 材料 168

9.3 证实Tn10d（Tc）插入与srl基因座的连锁 168

9.3.1 材料 168

9.3.2 步骤 168

9.4 使用Mud-P22作图确定zgc::Tn10d（Tc）插入的图位 168

9.5.2 步骤 169

9.5.1 材料 169

9.5 确定zgc::Tn10d[Tc]插入的相对图位:三点杂交 169

第十章 实验3转座子:将Tn10d插入调节基因 172

10.1.2 步骤 173

10.1.1 材料 173

10.1 构建Tn10d（Cm）的随机“跳跃” 173

10.2.2 步骤 174

10.2.1 材料 174

10.2. 将Tn10d（Cm）插入回交到野生型菌株 174

10.3.2 步骤 175

10.3.1 材料 175

10.3 检测reg::Tn10d（Cm）插入与srl操纵子的连锁 175

10.5 构建srl串联重复菌株 176

10.4.2 步骤 176

10.4 使用Tn10d（Cm）插入测定非连锁的Regc的遗图位 176

10.4.1 材料 176

10.5.2 步骤 177

10.5.1 材料 177

10.6.2 步骤 179

10.6.1 材料 179

10.6 连锁的RegcTn10d（Cm）插入的互补分析 179

第十一章 实验4 分离条件性突变体（热敏和琥珀突变） 181

11.1.2 步骤 182

11.1.1 材料 182

11.1 分离DES（硫酸二乙酯）诱导的srl突变体 182

11.2.1 材料 183

11.2 定域诱变:分离羟胺诱导的srl突变体 183

11.2.2 步骤 184

11.3.1 材料 185

11.3 温敏突变体的回交和鉴定 185

11.3.2 步骤 186

11.4.2 步骤 187

11.4.1 材料 187

11.4 琥珀抑制性突变体的回交和鉴定 187

12.1.1 材料 189

12.1 构建克隆文库 189

第十二章 实验5 体内分子克隆 189

12.1.2 步骤 190

12.2.2 步骤 191

12.2.1 材料 191

12.2 分离质粒DNA和证实Srl+表现型 191

12.3.2 步骤 192

12.3.1 材料 192

12.3 限制性内切酶消化和琼脂糖凝胶电泳 192

12.4.1 材料 193

12.4 亚克隆:限制性酶切化、连接和转化试验 193

12.4.2 步骤 194

13.1.2 材料 197

13.1.1 菌株 197

第十三章 实验6 使用脉冲场凝胶电泳进行细菌染色体的物理作图 197

13.1.3 步骤 198

实验7～11简介 202

14.1.1 材料 203

14.1 克隆了Nac结合位点（ Onαc）的质粒与噬菌体P22 mnt::Km9αrc（Am）的杂交 203

第十四章 实验7 攻击噬菌体P22的构建 203

14.1.2 步骤 204

14.2.1 材料 205

14.2 P22裂解物的PCR扩增和RFLP作图 205

14.2.2 步骤 206

14.3.1 材料 208

14.3 P22 DNA的RFLP作图 208

14.3.2 步骤 209

14.4.2 步骤 210

14.4.1 材料 210

14.4 使用体内选择Kmr溶原菌方法鉴定Onαc攻击噬菌体 210

15.3 步骤 213

15.2 材料 213

第十五章 实验8 攻击噬菌体的检测 213

15.1 细菌菌株 213

16.1.2 步骤 217

16.1.1 材料 217

第十六章 实验9 分离操纵子突变体 217

16.1 mutD诱变 217

16.2.2 步骤 218

16.2.1 材料 218

16.2 mutS诱变 218

16.3.2 步骤 219

16.3.1 材料 219

16.3 羟胺（NH2OH）诱变 219

16.4 选择突变的攻击噬菌体 221

16.4.2 步骤 222

16.4.1 材料 222

17.1 攻击噬菌体的PCR扩增和循环测序 224

第十七章 实验10 攻击噬菌体突变体的DNA序列分析 224

17.1.2 噬菌体DNA预扩增 226

17.1.1 材料 226

17.2.1 材料 227

17.2 使用32P标记的引物进行循环测序 227

17.2.2 使用T4多聚核苷酸激酶进行引物末端标记 228

17.2.4 非同位素DAN循环测序 229

17.2.3 使用同位素标记的引物进行双脱氧链终止法序列测定 229

17.3.1 材料 230

17.3 DNA测序胶的制备 230

17.3.2 步骤 231

17.3.3 放射性自显影 232

17.5 攻击噬菌体突变体的亚克隆和双链DNA序列分析 233

17.4.1 阅读DNA测序胶 233

17.4 银染方法 233

17.5.1 材料 234

17.5.2 将噬菌体DNA亚克隆到质粒载体上 235

17.5.4 双链质粒DNA测序 237

17.5.3 测序用质粒DNA的纯化 237

18.1 细菌菌株 239

第十八章 实验11 识别操纵子位点的第二位点抑制突变的分离 239

18.3 步骤 240

18.2 材料 240

实验12～15简介 246

19.1.1 材料 247

19.1 将TnphoA转入霍乱弧菌 247

第十九章 实验12 霍乱弧菌TnphoA插入体的分离 247

19.1.2 步骤 248

19.3.2 步骤 249

19.3.1 材料 249

19.2 利用质粒不相容性将载体 剔除 和表达phoA融合克隆子的分离 249

19.2.1 材料 249

19.2.2 步骤 249

19.3 具有TCP表现型插入体的鉴定 249

第二十章 实验13 用Southern DNA杂交对TnphoA插入作图 251

20.1.2 步骤 253

20.1.1 材料 253

20.1 DNA提取 253

20.3.1 材料 254

20.3 DNA限制性酶切分析及电泳分析 254

20.4.1 材料 255

20.4 将DNA转移到膜上 255

20.3.2 步骤 255

20.4.2 步骤 256

20.5 探针的制备 257

20.5.1 材料 257

20.5.2 步骤 258

20.6 杂交 259

20.6.1 材料 259

20.6.2 步骤 259

20.7 显影和显色 259

20.7.1 材料 259

20.7.2 步骤 259

20.8 融合插入点相关位置的作图 260

20.8.1 材料 260

20.8.2 步骤 260

第二十一章 实验14 使用自杀性质粒载体进行革兰氏阴性细菌的等位基因交换 262

21.1.1 材料 263

21.1 使用自杀性载体插入突变破坏taχR基因 263

21.1.2 步骤 264

21.2 使用表达核糖体蛋白S12的自杀性质粒将taxR点突变重组到染色体上 265

21.2.1 材料 265

21.2.2 步骤 266

第二十二章 实验15 寡核苷酸指导的位点特异性诱变 268

22.1.1 材料 269

22.1.2 步骤 269

22.1 单链DNA模板的分离 269

22.2.1 材料 271

22.2.2 步骤 271

22.2 诱变寡核苷酸的磷酸化 271

22.3.1 材料 272

22.3.2 步骤 272

22.3 诱变反应 272

22.4.1 材料 273

22.4.2 步骤 273

22.4 制备mutS转化体库的质粒DNA,转化入ctx-lαcZ指示菌株 273

22.5.1 材料 274

22.5.2 步骤 274

22.5 定点突变的回复突变 274

附录 278

第二十三章 附录A 细菌菌株、噬菌体和质粒 278

第二十四章 附录B 培养基及添加剂 286

24.1 液体培养基 286

24.2 固体培养基 287

24.3 培养基添加剂 289

24.4 抗生素 290

24.5 缓冲液 291

24.6 P22指示培养基 291

24.7 MOPS培养基 292

25.1 菌种保存 294

25.2 菌种运输 294

第二十五章 附录C 菌种收集 294

25.3 菌种记录 295

26.1.1 P22 HT裂解物的制备 297

26.1 使用P22噬菌体进行普遍性转导 297

26.1.2 转导试验（延迟性表达） 297

第二十六章 附录D 基因的交换和作图 297

26.2 用Mud-P22前噬菌体对鼠伤寒沙门氏菌快速作图 298

26.2.1 裂解物的制备 298

26.1.3 转导试验（平板转导） 298

26.2.2 噬菌体尾部的制备 299

26.2.3 作图 299

26.2.4 一些应该注意的问题 301

26.3.1 P22裂解物的小量制备 302

26.3.2 高滴度P22裂解物的制备 302

26.3 P22噬菌体裂解物 302

26.3.3 噬菌体滴度的滴定 303

26.4 DEAE-纤维素匀浆 304

26.5 羟胺诱变质粒DNA 304

26.3.4 从高滴度裂解物中提纯噬菌体DNA 304

26.5.1 缓冲液和溶液 305

26.6 感受态细胞的制备和转化 305

26.6.1 缓冲液和溶液 306

26.7.2 小量制备电感受态细胞 307

26.7.1 大量制备可冻存的电感受态细胞 307

26.7.3 电穿孔 307

26.7 电感受态细胞的制备和电转化 307

第二十七章 附录E 酶活性的测定 309

27.1 透化细胞的β半乳糖苷酶的活性测定 309

27.1.1 缓冲液和溶液 310

27.2 透化细胞的碱性磷酸酶活性测定 310

27.2.1 缓冲液和溶液 311

第二十八章 附录F 重组DNA方法 313

28.1 质粒DNA的小量制备 313

28.1.1 缓冲液和溶液 314

28.2 限制性内切酶缓冲液 315

28.3 乙醇沉淀 315

28.4 酚抽提法 316

28.4.1 TE饱和酚 316

28.5.1 Sephadex G-50离心柱 317

28.6 点滴透析 317

28.5 离心柱 317

28.7 琼脂糖凝胶电泳 318

28.7.1 缓冲液和溶液 318

28.8 非交性聚丙烯酰胺凝胶DNA电泳 319

28.8.1 缓冲液和溶液 320

28.9.2 фx174HαeⅢ(lμg/μ） 321

28.9.1 λHindⅢ（0.2μg/μl） 321

28.10 PCR产物的纯化和定量 321

28.9 常用的DNA分子量标准 321

28.10.1 用有机溶剂抽提纯化PCR产物 322

28.10.2 用MC滤器纯化丙烯酰胺凝胶的PCR产物 322

28.10.3 用Qiagen？亲和柱纯化PCR产物 323

28.10.4 用WizardTM制备物纯化PCR片段 323

28.10.5 PCR产物DNA浓度的测定 324

28.11 有 QIAquickTM凝胶抽提法纯化琼脂糖凝胶中的DNA条带 324

28.12 Southern杂交溶液 325

28.13 Southern溶液:GeniusTM系统 327

28.14 使用Souhtern和Western分析对融合体的结合点作图 328

28.15 寡核苷酸介导的位点特异性诱变 329

28.15.1 缓冲液和溶液 331

第二十九章 附录G 质粒和转座子限制性内切酶切图谱 332

29.1 质粒pALTER-1 333

29.2 质粒PEG5005 333

29.3 质粒PSU18和pSU19 334

29.4 质粒PgP704 335

29.5 质粒pkAS32和pkAS46 336

29.6 质粒ppy190 337

29.7 质粒pPC36 337

29.8 质粒PMS421 338

29.9 质粒pGW1700 338

29.10 Mu噬菌体衍生物 339

29.11 转座子Tn10衍生物 340

29.12 转座子TnphoA 341

参考文献 342

索引 372