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第一章 大肠杆菌的应用 1

一、菌株 1

(一)菌株的纯化 1

(二)菌株的来源 1

(三)常用的菌株 2

(四)谱系和遗传图 2

(五)菌株的生理测量 2

(六)菌株的保存 3

二、细菌的培养 3

(一)细菌的特性 3

(二)噬菌体的污染 5

(三)用作生理测量的菌株 6

(四)用作遗传学研究的菌株 7

(五)培养用于提纯某些分子的细菌 9

三、细胞密度的测量 9

四、细菌的大量培养 11

五、细胞的破碎 15

(一)超声波法 16

(二)氧化铝磨碎法 16

(三)玻璃珠磨碎法 16

(四)用溶菌酶破碎细胞 17

七、亚硝基胍的诱变作用 18

六、细菌的放射性标记 18

八、青霉素的选择作用 19

九、消除菌体中的 F-因子 20

(一)用吖啶橙消除 F-因子 21

(二)选择自发地消除 F-因子的菌株 21

(三)用十二烷基磺酸钠去除 F-因子 21

(四)用高温消除 F-因子 21

十、培育抗链霉素的菌株 22

十一、recA 和细菌的杂交 22

十二、P1噬菌体转导的遗传标记 23

十三、大量的遗传杂交 26

十四、利用转位子建立新的菌株 28

第二章 λ噬菌休 29

一、两株有用的突变株 29

(一)CI~(857) 29

(二)S~7 30

二、测定效价 30

三、平板原液的制备 31

四、大规模液体培养 34

五、提纯 36

六、遗传杂交 38

七、噬菌斑记数 39

八、筛选λ抗性突变株 40

九、测试菌落生长λ噬菌体的能力 41

十、构建溶原性细菌 42

十一、测试可能的溶原性细菌 44

十二、划线分离单噬菌斑 44

十三、选择缺失 45

第三章 酶的测定 47

一、β-半乳糖苷酶 47

二、RNA聚合酶 49

三、阿拉伯糖异构酶 51

四、溶菌酶 55

五、核酮糖激酶 57

六、大肠杆菌-偶联转录-翻译系统 62

第四章 蛋白质的实验 68

一、蛋白质的硫酸铵沉淀 69

二、利用相分配法去除核酸 71

(一)从核酸中分离大量蛋白质 72

(二)结合DNA或RNA的蛋白质的纯化 74

三、柱、分部收集器及其管道 75

四、离子交换层析和凝胶过滤 76

(一)离子交换树脂的制备 76

(二)装柱 77

(三)加样和洗脱 78

五、蛋白质浓度的测定 81

(一)光密度法 81

(二)双缩脲法 82

(三)Lowry法 82

(二)带有浓缩胶的SDS-10％丙烯酰胺凝胶 83

(四)Lowry法测定稀释的样品 83

六、浓缩蛋白质溶液 84

七、稳定蛋白质 85

八、蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳 86

(一)制备夹层凝胶 87

(三)尿素-SDS-丙烯酰胺梯度凝胶 93

(四)凝胶的染色 95

(五)[~3H]或[~(35)S]-标记的蛋白质在丙烯酰胺凝胶中的荧光图谱 96

(六)从DMSO溶液中回收PPO 97

第五章 核酸的实验 98

一、核酸的浓度和纯度测定 98

(一)光学方法 98

(二)荧光方法 99

二、DNA 的储备 101

三、DNA 的提纯 102

四、用乙醇沉淀DNA 105

五、TCA 沉淀测定 106

(一)用DEAE纯化DNA 108

八、λDNA 的分离 109

(一)苯酚抽提 110

九、质粒DNA的分离 111

(二)SDS抽提 111

十、大量分离质粒 117

十一、果蝇DNA的分离 120

十二、三磷酸核苷溶液的制备 123

十三、核苷的层析分析 124

十四、DNA的凝胶电泳 125

(一)琼脂糖凝胶电泳 127

(二)聚丙烯酰胺凝胶电泳 132

(三)凝胶的染色和照相 134

(四)从丙烯酰胺和琼脂糖凝胶中提取DNA 135

十五、限制性核酸内切酶酶切DNA的位点图谱 138

一、DNA 分子末端的连接 142

第六章 重组体DNA的构成与分析 142

(一)以S1酶消化制作钝性末端 143

(二)用T_4 DNA连接酶连接 143

(三)λ核酸外切酶消化产生游离3＇末端 145

(四)加入同聚物末尾 146

二、用质粒DNA使大肠杆菌转化 147

三、贮存含有质粒的菌株 149

四、重组体质粒的环丝氨酸选择 150

五、DNA和RNA的体外放射性同位素标记 151

(一)用缺口翻译放射标记DNA 151

(二)合成与DNA互补的放射标记的RNA 153

(三)合成与RNA互补的放射标记的DNA 155

(四)放射标记RNA或DNA的5＇末端 157

六、核酸杂交反应的一般性质 159

七、以核酸杂交筛选重组体DNA克隆 160

(一)筛选噬菌体空斑 161

(二)筛选菌落 164

八、从单个菌落中分离DNA 165

九、Southern 转移 166

十、选择与DNA互补的RNA 171

(一)制备 DNA 172

(二)制备 NBM纸 172

(三)使NBM纸转变成DBM纸以及结合DNA 172

(四)RNA与结合DBM的DNA杂交 173

(五)回收RNA 173

(六)NBPC(nitrobenzylpyridinikim chloride)的合成 174

十一、某些高级生物的体外翻译系统 176

(一)制备麦胚提取液 176

(二)麦胚翻译反应 178

(三)制备兔网织细胞溶解物 179

(四)细胞溶解物的微球菌核酸酶消化 180

(五)网织细胞翻译反应 180

十二、纯化总的和多核糖体 RNA 181

(一)从果蝇成虫中提纯 RNA 182

(二)从果蝇胚胎中提纯多核糖体RNA 183

十三、POLY-A~+(富含mRNA的)RNA的纯化 184

(一)制作蔗糖梯度 187

十四、用蔗糖梯度离心对RNA大小进行分级 187

(二)制备 RNA 188

(三)沉淀和收集 RNA 188

一、玻璃和塑料容器 189

第七章 辅助性实验室技术 189

二、玻璃器皿的硅化 190

三、吸管的洗涤 190

四、pH 计 191

五、缓冲液 193

(一)Tris 193

(二)磷酸 193

六、Beckman超速离心机 194

(一)离心管的充盈和平衡 194

(四)二甲砷酸盐 194

(二)用羟基磷灰石柱纯化DNA 194

(三)Good 氏缓冲液 194

(二)装转头 195

七、绘图 196

六、DNA 的聚乙二醇沉淀和大小分段 197

八、幻灯片和负片 197

(一)Polaroid幻灯片 197

七、大肠杆菌DNA的分离 198

(二)常规幻灯片和负片 198

九、胶片感光性 199

十一、透析袋 202

十二、酚的蒸馏 204

十三、回收用过的CsCl 205

十四、化学试剂的来源 206

十五、危害和警告 207

(一)干燥器、制备性离心机和真空泵 207

(二)化学试剂 207

(三)电的危害和防护 209

附录Ⅰ 常用试剂制备 212

附录Ⅱ 常用数据 222

参考文献 224

十、放射自显影和荧光照相 290