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前言 1

第1章 DNA与蛋白质相互关系 1

1.1 细胞核蛋白质的提取 1

1.1.1 细胞核蛋白质的提取 2

1.1.2 细胞核提取物的快速制备法 3

1.2 凝胶滞后实验 4

1.2.1 凝胶滞后实验 6

1.2.2 超级凝胶电泳 9

1.3 干扰实验 9

1.3.1 甲基化干扰实验 10

1.3.2 尿嘧啶干扰实验 13

1.4 脱氧核糖核酸酶I足迹分析 14

1.5 随机PCR 17

1.5.1 寡核苷酸的设计与合成 18

1.5.2 寡核苷酸的纯化 18

1.5.3 探针标记 19

1.5.4 凝胶滞后实验纯化探针 19

1.5.5 特异结合序列的克隆与序列分析 21

1.6 核酸-蛋白质杂交实验 22

1.6.2 标记探针 23

1.6.3 蛋白质变性、复性 23

1.6.1 电泳及电转移 23

1.6.4 杂交及放射自显影 24

参考文献 25

第2章 cDNA文库构建及目的基因的筛选 26

2.1 cDNA第一条链的合成 26

2.1.1 cDNA第一条链合成的策略 26

2.1.2 cDNA第一条链合成的操作步骤 27

2.2 cDNA第二条链的合成 29

2.2.1 置换合成法 30

2.2.2 PCR法 32

2.3.1 加尾载体作引物引导cDNA合成--定向克隆 37

2.3 cDNA克隆的其他策略 37

2.3.2 Okayama-Berg克隆法--定向克隆 38

2.3.3 末端加尾直接克隆--非定向克隆 39

2.3.4 加接头直接克隆--非定向克隆(双链cDNA末端无酶切位点) 39

2.3.5 加接头克隆--定向克隆(双链cDNA一端带酶切位点) 39

2.3.6 加连接子克隆--非定向克隆(双链cDNA末端无酶切位点) 40

2.3.7 加连接子克隆--定向克隆(双链cDNA一个末端带有酶切位点) 40

2.3.8 PCR产物的直接克隆--非定向克隆 40

2.3.9 PCR产物的黏端克隆法--定向克隆(两个PCR引物均带酶切位点) 41

2.3.10 无连接酶克隆法 41

2.4.1 根据遗传表型筛选 43

2.4 重组子的筛选与鉴定 43

2.5 构建cDNA文库新方法 44

2.4.2 分析重组子结构特征的筛选法 44

2.5.1 减数cDNA文库 45

2.5.2 标准化cDNA文库 45

2.6 mRNA差示显示技术 46

2.6.1 基本原理和方法 46

2.6.2 优化反应条件 49

2.6.3 差异显示技术在生物医学中的应用 50

2.6.4 差异显示技术存在的问题及改良措施 51

2.6.6 差异显示技术的展望 52

2.6.5 差异显示技术与相关方法的比较 52

2.7 人类基因组计划及后基因组计划 53

2.7.1 物理图谱的制作 53

2.7.2 测序及寻找新的功能因子 54

2.7.3 人类后基因组计划 57

参考文献 60

第3章 抗体工程 62

3.1 基因工程抗体的免疫学基础 62

3.1.1 免疫应答 62

3.1.2 抗体的分子结构和功能 63

3.1.3 抗体基因的DNA重排 65

3.1.4 抗体库的产生 67

3.1.5 抗原抗体的结合 68

3.2 噬菌体表面表达技术与噬菌体抗体 69

3.2.1 表达Fab段抗体的pComb3载体系统 69

3.2.2 表达scFv单链抗体pHEN1和pCANTAB5E的载体系统 71

3.2.3 抗体基因的大肠杆菌中的转录和翻译 72

3.2.4 Fab抗体或scFv抗体在细胞膜间隙的组装 72

3.3 基因工程重组抗体--Fab抗体 73

3.3.1 淋巴细胞的分离纯化 73

3.2.5 用于噬菌体抗体表达系统的大肠杆菌菌株 73

3.3.2 总细胞RNA的提取 74

3.3.3 cDNA的合成 75

3.3.4 PCR扩增Fab抗体基因 75

3.3.5 PCR产物的纯化 78

3.3.6 Fd和轻链基因的克隆及噬菌体抗体库的建立 79

3.3.7 噬菌体抗体库的富集筛选 80

3.3.8 噬菌体抗体库的菌落筛选法 81

3.3.9 Fab抗体在原核细胞中的可溶性表达 82

3.3.10 电转感受态菌XIL-BIu的制备 82

3.3.13 噬菌体毒种的滴定 83

3.3.11 电转感受态菌TGI的制备 83

3.3.12 辅助噬菌体毒种制备 83

3.4 基因工程重组抗体--单链抗体scFv 84

3.4.1 淋巴细胞的分离纯化 84

3.4.2 总细胞RNA的提取和cDNA的合成 84

3.4.3 PCR扩增抗体可变区基因及scFv单链抗体基因 84

3.4.4 Linker连接片段的制备 89

3.4.5 人单链Fv(seFv)片段的组装 89

3.4.6 seFv单链噬菌体抗体库的构建 90

3.4.7 单链噬菌体抗体库的富集筛选 91

3.4.8 seFv单链抗体融合表达和可溶性表达 92

3.5.1 抗Fab抗体亲和层析纯化法 93

3.5 Fab段抗体和scFv单链抗体表达产物的纯化和鉴定 93

3.5.2 Protein A·Sepharose柱层析纯化 94

3.5.3 金属离子亲和层析柱纯化 94

3.5.4 Fab抗体或scFv抗体的特异性鉴定 95

3.5.5 重组抗体可变区基因序列测定及分析 95

3.6 重组抗体全免疫球蛋白基因的表达 96

3.6.1 可变区基因与恒定区基因的连接--全抗体基因在哺乳类细胞中的表达 96

3.6.2 全IgG抗体基因的表达系统--重组杆状病毒系统 97

参考文献 100

4.1.1 丝状噬菌体的基本特征 101

第4章 丝状噬菌体表面显示技术的基本原理和应用 101

4.1 概述 101

4.1.2 噬菌体显示的基本原理和优势 103

4.1.3 噬菌体显示技术的发展和意义 103

4.1.4 噬菌体显示的基本策略 104

4.2 噬菌体随机多肽文库 104

4.2.1 概述 104

4.2.2 构建噬菌体肽库的操作步骤 110

4.3 噬菌体在cDNA文库表达和筛选中的应用 115

4.3.2 pJuFo载体应用举例 117

4.3.1 pJuFo载体的概述 117

4.3.3 pJuFo系统的筛选 119

4.3.4 pJuFo系统的应用 119

4.3.5 pJuFo系统优势和限制因素 119

4.4 噬菌体在蛋白质改造中的应用 120

4.4.1 选择突变蛋白质的一般原则 120

4.4.2 实验设计的一般步骤和程序 121

4.5 影响噬菌体筛选效率的因素 124

4.5.1 表达水平对筛选效率的影响 124

4.5.2 亲和力对筛选效率的影响 124

4.6.1 噬菌体肽库和抗体库 125

4.6 噬菌体表面显示技术相关的信息资源 125

4.6.2 抗噬菌体抗体 126

4.6.3 如何分析筛选结果 126

4.6.4 分子文库的WWW网址 126

参考文献 126

第5章 聚合酶链反应 129

5.1 基本PCR技术 129

5.1.1 基本步骤 130

5.1.2 实验条件的优化 131

5.2.1 基本步骤 133

5.2 RT-PCR 133

5.2.2 简化步骤 135

5.2.3 影响因素 135

5.3 单侧(锚式)PCR 136

5.3.1 扩增已知序列的下游片段 136

5.3.2 扩增已知序列的上游片段 137

5.3.3 注意事项 139

5.4 差异显示PCR 140

5.4.1 实验步骤 141

5.4.2 注意事项 143

5.5 免疫PCR 144

5.5.1 实验步骤 145

5.6 PCR-ELISA 147

5.5.2 注意事项 147

5.6.1 实验步骤 148

5.6.2 注意事项 148

参考文献 148

第6章 实用DNA突变技术 150

6.1 无表型选择的寡核苷酸介导的突变 151

6.1.1 突变原理 151

6.1.2 实验操作步骤 152

6.2.1 突变原理 154

6.1.3 注意事项 154

6.2 简并寡核苷酸诱变 154

6.2.2 实验操作步骤 156

6.2.3 注意事项 157

6.3 基因人工合成 157

6.3.1 突变原理 157

6.3.2 实验操作步骤 158

6.3.3 注意事项 159

6.4 区域特异性突变 159

6.4.1 突变原理 159

6.4.2 实验操作步骤 161

6.4.3 注意事项 162

6.5 DNA的接头分区突变 163

6.5.1 突变原理 163

6.5.2 使用巢式缺失的互补寡核苷酸的接头分区突变(基本方案) 164

6.5.3 使用寡核苷酸定位的接头分区突变(替代方案) 166

6.5.4 注意事项 166

6.6 PCR介导的突变 166

6.6.1 通过PCR方法引入限制性酶切位点原理(基本方案1) 167

6.6.2 实验操作步骤 168

6.6.4 实验操作步骤 169

6.6.3 通过PCR方法引入点突变原理(基本方案2) 169

6.6.5 通过连续PCR引入点突变原理(替代方案) 170

6.6.6 实验操作步骤 170

6.6.7 注意事项 172

参考文献 172

第7章 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 174

7.1 外源基因导入哺乳动物细胞中的技术方法 174

7.1.1 磷酸钙沉淀转染法 175

7.1.2 DEAE-葡聚糖转染法 177

7.1.3 脂质体介导的转染 180

7.1.4 电穿孔转染法 181

7.1.5 基因枪粒子轰击法 183

7.1.6 受体介导的基因导入法 184

7.2 病毒载体介导的基因转移 186

7.2.1 通过反转录病毒系统表达外源基因的原理 187

7.2.2 建立特异的产反转录病毒细胞系(基本方法) 189

7.2.3 通过腺病毒载体系统表达外源基因 194

7.3 报告基因的表达及检测 195

7.3.1 半乳糖苷酶基因 197

7.3.2 氯霉素乙酰转移酶基因 198

7.3.3 荧光素酶基因 200

7.3.4 绿色荧光蛋白基因 201

7.3.5 人生长激素基因 202

7.3.6 分泌型的碱性磷酸酶基因 203

7.3.7 β-葡萄糖醛酸酶基因 203

7.4 外源基因的稳定表达 203

7.4.1 保留稳定转化细胞系的常用选择标记 204

7.4.2 分离稳定转化细胞系的基本步骤(基本方法) 205

参考文献 206

8.1 DNA测序方法概述 208

8.1.1 DNA测序方法的分类 208

第8章 DNA 序列测定 208

8.1.2 DNA测序的策略 211

8.1.3 双脱氧测序法和化学测序法的选择 216

8.1.4 DNA测序技术的进展 216

8.2 构建DNA测序用的嵌套缺失 218

8.2.1 用外切酶Ⅲ(ExoⅢ)构建单一方向的缺失(基本操作) 219

8.2.2 用［a-35S］dNTPs保护DNA使其免受外切酶Ⅲ(ExoⅢ)的消化 222

8.2.3 用Bal31核酸酶构建嵌套缺失(基本操作) 223

8.2.4 制备M13mp测序载体来亚克隆Bal31消化的DNA片段 228

8.2.5 注释 229

8.3 DNA序列测定模板的制备 230

8.3.1 单链M13噬菌体DNA的制备 231

8.3.2 从小量细胞裂解液中制备λDNA模板 233

8.3.3 化学测序所需重组pSP64CS或pSP65CS质粒DNA的微量制备 234

8.3.4 双脱氧法测序所需双链质粒DNA的微量制备 234

8.3.5 双脱氧法测序所需双链质粒DNA的碱变性 235

8.3.6 从一个大肠杆菌菌落中制备质粒DNA或从一个噬菌斑中制备噬菌体DNA用于热循环测序 236

8.3.7 注释 236

8.4 DNA双脱氧测序法 237

8.4.1 用测序酶(Sequenase)来标记/终止测序反应(基本操作) 242

8.4.3 在标记/终止测序反应中使用其他DNA聚合酶(替代操作2) 244

8.4.2 在标记/终止反应中使用Mn2+离子(替代操作1) 244

8.4.4 Klenow片段进行Sanger法测序(基本操作) 245

8.4.5 利用Taq DNA聚合酶Sanger反应(替代操作) 245

8.4.6 利用5＇末端标记引物进行一步法测序(替代操作2) 246

8.4.7 利用同位素标记核苷酸进行热循环测序反应(基本操作)) 247

8.4.8 利用5＇端引物标记进行热循环测序反应(替代操作) 248

8.4.9 注释 249

8.5 用化学发光检测法进行DNA双脱氧测序 258

8.5.1 用生物素化引物进行化学发光检测的DNA测序(基本操作) 261

8.5.3 用半抗原标记引物进行测序，用抗体-碱性磷酸酶偶联物进行检测(替代操作2) 263

8.5.2 用链霉抗生物素蛋白和生物素化碱性磷酸酶进行两步(间接)检测(替代操作1) 263

8.5.4 注释 264

8.6 化学法测定DNA序列 267

8.6.1 策略设计 267

8.6.2 用32P标记DNA的化学测序(基本操作) 268

8.6.3 Tth1111消化和末端标记(替代操作) 271

8.6.4 注释 272

8.7 变性凝胶测定电泳 272

8.7.1 灌胶、电泳和测序凝胶的处理(基本操作) 274

8.7.2 缓冲液梯度测序凝胶(替代操作1) 276

8.7.3 电解质梯度测序凝胶(替代操作2) 276

8.7.5 注释 277

8.7.4 含甲酰胺的测序凝胶(替代操作3) 277

参考文献 278

第9章 蛋白质的表达 280

9.1 外源基因在原核细胞中的表达 280

9.1.1 蛋白质在原核细胞中的表达特点 280

9.1.2 蛋白质在原核细胞表达的调控 281

9.1.3 蛋白质在原核细胞中的表达形式 281

9.1.4 T7启动子的原核表达系统 282

9.1.5 利用pET载体在大肠杆菌中表达外源基因的基本操作 283

9.2 外源基因在哺乳动物细胞内的表达 287

9.2.1 病毒介导的基因表达 288

9.2.2 重组痘苗病毒共表达汉坦病毒M和S片断的操作步骤 289

9.2.3 外源基因在哺乳动物细胞中的瞬时表达 295

9.2.4 痘苗病毒瞬时表达T7RNA聚合酶的操作步骤 296

9.2.5 外源基因在哺乳动物细胞系中的稳定表达 297

9.2.6 哺乳动物细胞系稳定表达汉坦病毒S片断的操作步骤 299

9.3 外源基因在杆状病毒系统的表达 303

9.3.1 杆状病毒系统表达外源基因的特点和策略 303

9.3.2 杆状病毒表达汉坦病毒M片断的操作步骤 306

9.4.1 免疫荧光(IFA)的原理和基本操作 310

9.4 重组蛋白的检测和鉴定 310

9.4.2 酶联免疫吸附试验 312

9.4.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本操作 313

9.4.4 蛋白印迹试验的基本操作 315

9.4.5 放射免疫沉淀的原理和基本操作 316

参考文献 317

第10章 蛋白质与蛋白质相互作用的研究策略 318

10.1 蛋白质间相互作用的形式和作用力 318

10.1.1 蛋白质间相互作用的形式 318

10.1.2 蛋白质之间相互作用的作用力 319

10.2.1 蛋白质配体结合结构域的筛选 320

10.2 蛋白质间相互作用的研究策略 320

10.2.2 蛋白质配体的筛选 323

10.3 酵母双杂交系统的操作程序 327

10.3.1 酵母双杂交系统操作的基本流程 327

10.3.2 实验材料 327

10.3.3 基本实验方法 330

10.4 注释 334

参考文献 334

第11章 生物芯片技术 336

11.1 生物芯片技术的发展 336

11.2.1 基因芯片 337

11.2 生物芯片的类型 337

11.2.2 蛋白芯片 339

11.2.3 缩微芯片 340

11.3 生物芯片应用的大致操作流程 342

11.3.1 探针的设计、合成与芯片的制作 342

11.3.2 靶基因样品的制备 344

11.3.3 杂交 344

11.3.4 杂交信号的检测与结果的分析 345

11.4 生物芯片应用的具体操作方法 346

11.4.1 cDNA微点阵 346

11.4.2 寡核苷酸微点阵 349

11.5 生物芯片技术的应用 350

11.5.1 利用DNA芯片进行DNA序列的测定 350

11.5.2 利用芯片技术进行基因突变的检测 351

11.5.3 用于基因转录水平的监测、基因组分析和后基因组研究 352

11.6 前景与展望 354

参考文献 355

第12章 生物信息学 357

12.1 概述 357

12.2 生物信息数据库与查询 359

12.2.1 基因和基因组数据库 359

12.2.2 蛋白质数据库 361

12.2.3 功能数据库 363

12.2.4 其他数据库资源 364

12.3 序列比对和数据库搜索 364

12.3.1 序列两两比对 365

12.3.2 多序列比对 368

12.4 核酸与蛋白质结构和功能的预测分析 368

12.4.1 针对核酸序列的预测方法 369

12.4.2 针对蛋白质的预测方法 371

12.5 分子进化 373

12.5.1 分子进化钟与中性理论 373

12.5.2 进化树 374

12.6 基因组序列信息分析 378

12.6.1 基因组序列分析工具 378

12.6.2 人类和鼠类公共物理图谱数据库的使用 379

12.6.3 基因组比较 382

12.6.4 SNP预测 382

12.7 功能基因组相关信息分析 383

12.7.1 大规模基因表达谱分析 383

12.7.2 基因组水平蛋白质功能综合预测 389

参考文献 390

附录1 实验室细胞培养的若干问题 392

附录2 常用溶液与配制 399