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第一章　组织细胞培养技术 1

第一节　培养室的基本条件 1

一、培养室设置 1

二、培养室仪器、器械及器皿 1

目录 1

第二节　培养试剂 2

一、水、平衡盐液 2

二、培养基 3

三、底物溶液 3

四、培养基添加剂 3

五、消化液 3

八、清洁液的配制和使用注意事项 4

六、pH调整液 4

七、抗生素液 4

第三节　细胞培养的基本技术 5

一、清洗 5

二、包装及消毒 5

三、无菌操作 5

四、取材 5

五、细胞分散法 6

六、淋巴细胞分离法 6

七、细胞计数 6

第四节　原代培养 6

第五节　传代培养 7

一、操作步骤 7

二、注意事项 7

一、操作步骤 8

二、注意事项 8

第六节　体内细胞培养 8

一、瘤细胞悬液接种 8

二、腹水瘤的建立与腹水瘤的接种 8

第七节　培养细胞的观察 8

一、细胞培养常规检查（活细胞直接观察） 8

二、环境 9

一、营养 9

第八节　影响细胞生长的因素 9

二、细胞生物学检测 9

第九节　细胞培养污染的控制 10

一、污染的概念 10

二、污染的种类及表现 10

三、污染的预防及消除 10

四、支原体污染的对策 10

第十节　培养细胞的冻存、复苏与运输 11

一、细胞冻存 11

二、复苏方法 12

三、细胞运输 12

一、培养基的基本成分 13

第一节　培养基 13

第二章　细菌培养技术 13

二、培养基制备的一般程序 14

三、常用培养基 14

第二节　细菌培养法 17

一、细菌检验室的一般注意事项及无菌技术 17

二、接种环和接种针的使用 17

三、接种操作区 17

四、接种法 18

五、培养法 19

二、巨噬细胞吞噬功能试验 21

一、中性粒细胞吞噬功能检测 21

第一节　机体非特异性免疫功能检测 21

第三章　免疫学技术 21

第二节 抗体及其相关技术 22

一、免疫血清的制备 22

二、直接凝集反应 22

三、沉淀反应 24

第三节 细胞免疫测定 25

一、淋巴细胞转化试验 25

二、体外抗体形成细胞的检测 25

第四节 免疫标记技术 26

一、酶联免疫吸附试验 26

二、免疫荧光技术 27

三、放射免疫测定法 28

一、杂交瘤的基本原理 29

二、实验材料 29

三、杂交瘤细胞制备 29

第五节　单克隆抗体技术 29

四、杂交瘤细胞的选择性培养 30

五、杂交瘤细胞筛选 31

六、杂交瘤细胞的克隆化 31

七、单克隆抗体腹水的制备 31

一、免疫组化实验室的建设 32

二、免疫组化试剂的选择 32

第一节　免疫组化实验室的建设和试剂的保存 32

第四章　免疫组织化学实用技术 32

三、抗体的配制和保存 33

四、常用免疫组化缓冲液的配制和保存 34

第二节　组织标本的处理 35

一、组织标本的取材 35

二、组织标本的固定 35

三、组织的脱水、透明、浸蜡 37

四、组织样本的包埋 37

第三节　组织切片的准备 37

一、一般性准备工作 37

二、载玻片的清洁 37

第四节　组织切片的制作 38

一、石蜡切片法制作过程 38

三、载玻片的表面处理 38

四、盖玻片的处理 38

二、冷冻切片法制作过程 39

第五节　常用免疫组化染色方法 39

一、酶标抗体法 39

二、酶桥法（enzyme bridge method） 39

三、PAP法（peroxidase antiperoxidase method，过氧化物酶抗过氧化物酶法） 40

四、双PAP法 40

五、BRAB法（bridged avidin-biotin technique，桥抗生物素-生物素技术） 41

六、LAB法（labelled avidin-biotin technique，标记生物素-抗生物素技术） 41

七、SPA-HRP用于间接法的染色 41

十、快速ABC法（antibody-avidin-biotin-HRP complex，抗体-亲和素-生物素过氧化物酶复合物法） 42

八、SPA用于PAP法 42

九、ABC法（avidin-biotin-peroxidase complex，抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物法） 42

十一、二步ABC法 43

十二、SABC法 43

十三、SP（streptavidin-peroxidase，SP）免疫组化法 43

十四、Envision Ⅰ法 44

十五、CSA法（catalyzed signal amplific-ation，CSA催化信号放大法） 44

第六节　内源性酶的消除和血清封闭 45

第七节　抗原修复 45

一、蛋白酶消化法 46

二、热诱导抗原修复 47

四、抗原热修复应注意的问题 49

三、蛋白酶消化法与热修复法的联合应用 49

第八节　抗体孵育 50

第九节　免疫组化切片的显色 50

一、辣根过氧化物酶标记的免疫组化试剂盒的显色 50

二、碱性磷酸酶标记的免疫组化试剂盒的显色 51

三、免疫组化显色中的注意事项 51

第十节　免疫组化切片的复染和封固 52

一、常用的复染方法 52

二、常用的封固方法 53

三、常见免疫组化标记酶的种类和显色剂、复染剂、封片剂间的匹配 53

第十一节　免疫组化染色结果的判断 54

一、免疫组化对照的设置 54

一、对照切片和待检测组织切片均无着色 55

二、特异性染色和非特异性染色的鉴别 55

第十二节　免疫组化常见问题及其处理方法 55

二、阴性对照没有染色，而阳性对照标本和待检测组织切片呈弱阳性 56

三、切片染色太深或整张切片均出现染色 56

四、切片上有许多杂质 57

五、没有复染色或复染色太浅 57

六、复染色太深或复染和DAB反差太小 57

七、染色标本未按所期望的表达（浆以及核） 57

八、所有切片包括阴性对照切片均呈现弱阳性反应 58

九、所有切片均出现非特异性背景染色 58

十、阳性对照染色良好，待检测切片均无阳性反应，呈现假阴性 59

十一、切片着色不匀 59

一、设计策略 60

第二节　组织芯片的制备 60

第五章　组织芯片技术 60

第一节　概述 60

二、制备方法 61

三、组织芯片的检测 62

四、组织芯片与基因芯片、蛋白芯片的区别 62

第三节　组织芯片技术的优点 62

一、可提高组织学实验的效率 62

五、有利于节约实验试剂 63

二、组织芯片技术的应用领域 63

第四节　组织芯片的应用 63

一、组织芯片的应用方式 63

四、有利于原始存档蜡块的保存 63

三、便于设置实验对照 63

二、有助于减少实验误差 63

第五节　组织芯片存在的问题 64

一、组织芯片的制备问题 64

二、组织芯片分析的自动化问题 64

三、建立组织库的问题 64

第六章　染色体分析技术 65

第一节　人体外周血细胞培养及染色体标本制备 65

一、实验原理 65

二、实验用品 66

三、分析步骤 66

第三节　染色体核型分析 67

三、分析步骤 67

一、实验原理 67

第二节　染色体G显带技术 67

二、实验用品 67

第四节　染色体荧光原位杂交技术 68

一、实验原理 68

二、实验用品 69

三、分析步骤 69

三、分析步骤 70

一、实验用品 70

四、结果分析 70

第六节　人体染色体脆性位点检测方法 70

二、实验用品 70

一、实验原理 70

第五节　微核检测方法 70

二、分析步骤 71

第七节　人类体细胞X染色质检测方法 71

一、实验用品 71

二、分析步骤 71

第八节　姐妹染色单体分化染色法（SCE） 71

一、实验原理 71

二、器材与试剂 72

三、分析步骤 72

第七章　蛋白质研究技术 73

第一节　蛋白质的提取和溶解 73

一、蛋白质的破碎和溶解 74

二、包涵体蛋白质的溶解 75

第二节　蛋白质浓度的测定 75

一、紫外吸收法 76

二、Lowry法（Folin-酚法） 76

三、Bradford法（考马斯亮蓝G-250染色法） 77

第三节　蛋白质分离纯化技术 77

一、蛋白质样品的浓缩 77

二、离子交换层析 80

三、疏水作用层析 86

第四节　蛋白质的分析鉴定 93

一、电泳分析 93

二、蛋白质免疫印迹分析 97

三、蛋白质变性和复性分析 100

第五节　蛋白质的双向凝胶电泳技术 102

一、样品的制备 103

二、第一向电泳（等电聚焦，IEF） 104

三、凝胶的平衡 105

四、第二向电泳（SDS-PAGE） 105

五、染色 105

六、图像捕获与分析 107

七、注意事项 107

第八章　核酸研究技术 108

第一节　限制性内切酶消化DNA 108

二、单酶消化DNA样品反应 109

一、材料 109

三、多限制性内切酶消化DNA样品 110

四、注意事项 110

第二节　核酸探针标记 111

一、放射性核素α-32P随机引物延伸标记方法 111

二、光敏生物素标记方法 112

三、地高辛标记的DNA探针 113

第三节　斑点／狭缝杂交技术 113

一、仪器及试剂 114

二、方法 114

三、注意事项 115

第四节　Southern印迹技术 116

一、仪器与试剂 117

二、方法 117

三、注意事项 118

第五节　Northern印迹技术 119

一、材料与试剂 119

二、方法 119

三、注意事项 120

第六节　原位杂交技术 120

一、材料与试剂 121

二、方法 122

三、注意事项 122

第一节　PCR技术的基本原理 125

第九章　PCR技术及其应用 125

第二节　PCR反应体系的组成及影响扩增效率的因素 126

一、PCR反应体系的组成 126

二、基础PCR及最佳条件 127

三、耐热性DNA聚合酶 130

四、引物的设计合成 133

第三节　模板DNA的制备 136

一、模板DNA制备的基本方法 136

二、临床标本制备模板DNA 138

三、穿刺细胞DNA的提取 139

五、胰液标本的DNA的提取 140

四、石蜡包埋标本DNA的提取 140

六、RNA模板的制备 141

第七节　常用的PCR产物检测方法 142

一、琼脂糖凝胶电泳 142

二、聚丙烯酰胺凝胶电泳 142

三、PCR产物的核酸杂交检测 142

第八节　影响PCR扩增效率的因素 143

第九节　非同位素探针的PCR标记法 144

一、标记的相关因素 144

二、标记的步骤 144

三、注意事项 145

第十节　定量PCR 145

一、DNA的定量 145

二、RNA的定量 146

第十一节　PCR中常出现的问题及解决方法 150

一、PCR中常出现的问题 150

二、PCR中出现的问题及解决方法 152

第十章　PCR衍生技术 153

一、热启动PCR 153

二、LA PCR 154

三、套式PCR 158

四、反转录PCR 158

五、锚定PCR 158

六、PCR-ELISA 162

七、免疫PCR 162

八、原位PCR 164

九、序列特异性引物PCR 166

十、单链构型多态性（一个碱基置换的简便检出法） 167

十一、PCR-SSOP法 169

十二、RNase保护法 170

十三、微量DNA变异的检测 171

十四、变性梯度凝胶电泳 173

十五、限制性片段长度多态性 174

十六、用PCR分析大范围的DNA变异——差异显示分析法（DDA） 175

十七、用PCR分析大范围的DNA变异——代表性差异显示分析法（RDA） 175

十八、mRNA差异显示PCR 176

十九、随机扩增的多态性DNA 180

二十、AP-PCR 181

二十一、PCR克隆 183

二十二、PCR产物的碱基测序 184

二十三、用λ核酸外切酶测定碱基序列 186

二十四、用PCR导入基因突变 188

二十五、同源重组子的PCR筛选法 189

二十六、cDNA末端快速扩增 189

二十七、cDNA文库的构建及筛选 193

二十八、利用PCR技术建立染色体探针池 193

二十九、用连接酶介导的PCR进行DNase足迹分析 194

三十、柄式PCR（Panhandle） 200

三十一、表达PCR（E-PCR） 201

三十二、用SNuPE分析法定量分析等位基因特异性序列中单一核苷酸差异 203

三十三、应用连接介导PCR进行基因组DNA测序和足迹分析 204

三十四、应用任意引物PCR进行DNA指纹分析 206

第十一章　药理学常用研究方法 209

第一节　新药临床研究的盲法设计 209

一、盲法设计的目的和原则 209

二、简单设盲法 210

三、平行随机设盲法 210

第二节　受体动力学研究 210

一、药物-受体结合的定量关系 211

二、量-效关系的运算过程 213

第三节　药物动力学研究 217

一、概述 217

二、单室模型 218

三、两室模型 220

四、多次口服给药 221

五、生物利用度 222

第四节　生物等效性检验的计算及计算程序 223

一、生物等效性检验与显著性检验 223

二、生物等效性检验的理论根据 223

三、常用生物等效性检验方法 224

第十二章　实验动物和动物实验 226

第一节　实验动物学的基本概念和基本内容 226

一、实验动物 226

二、实验动物微生物质量控制 227

三、实验动物遗传质量控制 228

第二节　动物实验 229

第三节　人类疾病动物模型 231

一、动物模型的含义 231

二、人类疾病动物模型的设计原则 232

第四节　转基因动物 232

一、转基因（transgenic animal）动物的概念 233

二、基因的结构和调控 233

三、用显微注射法制作转基因小鼠 233

四、利用胚胎干细胞制作转基因小鼠 237

五、复制缺陷型反转录病毒作为载体的方法 240

六、精子作为载体的方法 241

七、整合外源基因体细胞核移植的方法 241

十、应用 242

九、展望 242

八、几种转基因动物制作方法比较 242

第五节　动物克隆技术进展 243

一、动物克隆的理论依据 243

二、动物克隆的技术可行性 244

三、动物克隆存在的问题 245

四、转基因克隆技术 246

五、讨论与建议 246

六、动物克隆技术应用前景 246

第六节　卵巢移植和体外受精 248

一、卵巢移植 248

二、体外受精 248

一、抓取和固定的方法 249

第七节　常用动物实验方法 249

二、性别判定 252

三、动物编号的标记方法 252

四、给药方法 254

五、麻醉法 256

六、采血 258

七、安乐死法 259

八、交配和妊娠的确认 261

九、动物实验室的消毒 261

第十三章　临床实验研究常用统计学方法 263

第一节　概述 263

一、统计学在临床实验研究中的作用 263

二、统计学方法应用的基本步骤 264

三、统计方法的选用 265

第二节　临床实验研究设计 266

一、实验研究的分类及其基本要素 266

二、实验设计的基本原则 268

三、随机化分组方法 269

四、样本含量估计方法 270

五、临床实验中常用的设计方法 271

六、实验中的盲法 273

七、剂量和量效关系设计 273

第三节　临床实验研究常用统计分析方法 274

一、计数资料的统计方法 274

二、计量资料统计方法 275

第四节　临床研究论文写作的统计要求 277

一、摘要 277

二、材料与方法 277

三、结果 277

四、讨论 279

第十四章　常用器械消毒与处理 281

一、清洗 281

二、灭菌法 282

三、消毒法 284

附录Ⅰ 常用词汇中英文对照 285

附录Ⅱ 常用单位 292

参考文献 293