精编分子生物学实验指南 第4版PDF电子书下载

第1章 大肠杆菌、质粒和噬菌体 1

1.1.1 极限培养基 2

1.1 培养基及常用工具的准备 2

1.1.2 丰富培养基 3

1.1.4 顶层琼脂培养基 4

1.1.3 固体培养基 4

1.1.6 实验工具 5

1.1.5 穿刺琼脂培养基 5

1.2.3 基本方案3 细菌培养的监测 6

1.2.2 基本方案2 大体积培养 6

1.2 在液体培养基中培养 6

1.2.1 基本方案1 过夜培养 6

1.3.3 基本方案3 通过铺平板分离单个菌落 7

1.3.2 基本方案2 通过平板划线法分离单菌落 7

1.3 在固体培养基中培养 7

1.3.1 基本方案1 通过连续稀释法滴定和分离细菌菌落 7

1.3.5 辅助方案2 菌株的保存和复苏 8

1.3.4 辅助方案1 影印平板 8

1.4 经典细菌遗传学选论 9

1.5 质粒图谱 13

1.6.2 备择方案 96孔微量滴定板碱裂解法 20

1.6.1 基本方案1 碱裂解小量制备 20

1.6 质粒DNA的小量制备 20

1.6.3 基本方案2 煮沸小量制备法 21

基本方案1 碱裂解法 22

1.7.1 粗制裂解物的制备 22

1.6.4 辅助方案 质粒DNA的保存 22

1.7 质粒DNA的大量制备 22

基本方案2 氯化铯／溴化乙锭平衡离心法 23

1.7.2 备择方案 利用离子交换层析和分子筛层析纯化质粒DNA 24

1.8.1基本方案1 CaCl2转化法 25

1.8 将质粒DNA导入细菌细胞 25

1.8.2 备择方案 一步法制备和转化感受态细菌 26

1.8.3 基本方案2 高效率的电转化方法 27

1.9 λ噬菌体概述 28

1.9.1 裂解性生长 29

1.9.2 溶原性生长 30

1.10.2 选择插入的DNA 31

1.10.1 用λ噬菌体的优点 31

1.10 作为克隆载体的λ噬菌体 31

1.11.1 基本方案1 通过连续稀释法分离单个噬斑 34

1.11 λ噬菌体铺平板产生噬斑 34

1.10.3 λ噬菌体来源的克隆载体的图谱 34

1.11.2 基本方案2 噬菌体转染和体外包装 35

1.12.1 基本方案 通过平板裂解制备噬菌体库 36

1.12 培养λ衍生的噬菌体载体 36

1.13.1 基本方案 通过分级平衡梯度离心制备DNA 37

1.13 从噬菌体裂解液中制备λDNA 37

1.12.2 备择方案 制备液体裂解物 37

1.14 源于丝状噬菌体的载体 39

基本方案 利用辅助噬菌体从质粒制备单链DNA 42

1.15 M13噬菌体衍生载体的制备和应用 42

第2章 DNA的制备和分析 44

2.1 A水溶液中DNA的纯化和浓缩 45

2.1A.3 辅助方案1 酚的平衡及酚／氯仿／异戊醇的配制 46

2.1A.2 备择方案1 异丙醇沉淀DNA 46

2.1A.1 基本方案 DNA的酚抽提和乙醇沉淀 46

2.1A.4 辅助方案2 丁醇浓缩DNA 47

2.1A.6 备择方案2 玻璃珠法纯化DNA 48

2.1A.5 辅助方案3 醚抽提法去除残存酚、氯仿或丁醇 48

2.1A.7 备择方案3 RNA及DNA稀溶液的纯化和浓缩 49

基本方案 50

2.1 B阴离子交换色谱法纯化DNA 50

2.1A.8 备择方案4 乙醇沉淀法去除低分子量的寡核苷酸和核苷三磷酸 50

基本方案 52

2.2 从哺乳动物组织中制备基因组DNA 52

2.3.1 基本方案 氯化铯离心法制备植物DNA 53

2.3 从植物组织中制备基因组DNA 53

2.3.2 备择方案 用CTAB制备植物DNA 54

2.4.1 基本方案 细菌基因组DNA的小量制备 55

2.4 从细菌中制备基因组DNA 55

2.4.3 辅助方案 从所得到的基因组DNA制备物中除去多糖 56

2.4.2 备择方案 氯化铯法大规模制备细菌基因组DNA 56

2.5A.1 基本方案 大片段DNA在琼脂糖凝胶上的分离 57

2.5A 琼脂糖凝胶电泳 57

2.5A.2 辅助方案 微型凝胶及中型凝胶 58

2.5B.1 基本方案 倒转电场凝胶电泳 59

2.5B 脉冲场凝胶电泳 59

2.5B.2 备择方案 钳位均匀电场电泳（CHEF电泳） 60

2.5B.3 辅助方案 高分子量DNA样品和分子量标准物的制备 61

2.6.1 基本方案1 琼脂糖凝胶电洗脱 62

2.6 从琼脂糖凝胶中分离和纯化大的DNA限制性酶切片段 62

2.6.2 基本方案2 NA-45纸电泳 63

2.6.3 基本方案3 用低熔点琼脂糖凝胶分离DNA片段 64

2.6.5 备择方案2 用玻璃珠法从低熔点琼脂糖凝胶中回收DNA 65

2.6.4 备择方案1 使用β－琼脂糖酶消化法从低熔点琼脂糖凝胶中回收DNA 65

2.7.1 基本方案1 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 66

2.7 用常规的凝胶电泳分离小分子DNA片段 66

2.6.6 辅助方案 用溴化乙锭斑点定量法对DNA浓度进行快速估测 66

2.7.3 基本方案2 筛分型琼脂糖凝胶电泳 68

2.7.2 备择方案 通过电洗脱从聚丙烯酰胺凝胶纯化片段 68

2.8 DNA的毛细管电泳 69

2.8.1 基本方案1 寡核苷酸的分离 72

2.8.3 备择方案 基因型分析 74

2.8.2 基本方案2 定量PCR分析 74

2.9A.1 基本方案 用高盐缓冲液在尼龙膜或硝酸纤维素膜上进行Southern印迹 75

2.9A Southern印迹法 75

2.9A.2 辅助方案 紫外透射仪的校准 77

2.9A.4 备择方案2用向下毛细管转移法进行Southern杂交 78

2.9A.3 备择方案1用碱性缓冲液在尼龙膜上进行Southern印迹 78

2.9A.5 备择方案3从聚丙烯酰胺凝胶至尼龙膜的电转印法 79

2.9B.1 基本方案 用多样抽滤加样器在不带电荷的尼龙膜和硝酸纤维素膜上进行DNA斑点和狭线印迹 80

2.9B DNA的斑点和狭线印迹 80

2.9B.2 备择方案1 用多样抽滤加样器在带正电荷的尼龙膜上进行DNA斑点和狭线印迹 81

2.9B.3 备择方案2 DNA斑点印迹的手工制备 82

2.10.1 基本方案 放射性标记的DNA探针对DNA印迹的杂交分析 83

2.10 DNA印迹的杂交分析 83

2.10.2 备择方案 用放射性标记的RNA探针对DNA印迹进行杂交分析 87

基本方案 89

2.11 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化寡核苷酸 89

2.10.3 辅助方案 从杂交膜上除去探针 89

第3章 DNA和RNA的酶学操作 93

3.1.1 基本方案 单酶单DNA样品消化 94

3.1 限制性内切酶消化DNA 94

3.1.2 备择方案1 多限制性内切酶消化DNA样品 97

3.1.5 辅助方案 DNA的甲基化 98

3.1.4 备择方案3 限制性内切酶对DNA样品的部分消化 98

3.1.3 备择方案2 消化多个DNA样品 98

基本方案 100

3.3 用限制酶部分消化进行DNA作图 100

3.2 用多种酶消化进行DNA作图 100

基本方案 100

3.4.2 10×酶缓冲液 101

3.4.1 贮液 101

3.4 核酸操作的常用试剂和放射性同位素 101

3.4.3 酶反应条件及应用 103

3.4.4 核苷三磷酸（NTP） 104

基本方案 酸沉淀法测定DNA和RNA中的放射性 108

3.4.5 标记核酸的放射性同位素 108

备择方案 柱离心法分离放射性标记DNA 109

3.5 依赖于DNA的DNA聚合酶 110

基本方案3 随机寡核苷酸引物介导的DNA标记 112

基本方案2 修复突出的3′或5′末端以产生平端 112

3.5.1 大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段 112

基本方案1 标记DNA的3′末端 112

3.5.2 T4 DNA聚合酶 113

3.5.3 天然T7噬菌体DNA聚合酶 114

3.5.4 经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶 115

3.6 不依赖于模板的DNA聚合酶 116

3.5.5 TaqDNA聚合酶 116

3.7 依赖RNA的DNA聚合酶 117

3.9 不依赖DNA的RNA聚合酶 119

3.8 依赖DNA的RNA聚合酶 119

3.10.2 T4噬菌体多核苷酸激酶 120

3.10.1 碱性磷酸酶 120

3.10 磷酸酶和激酶 120

3.11.1 单链5′→3′和3′→5′外切核酸酶 121

3.11 外切核酸酶 121

基本方案1 正向反应标记5′端 121

基本方案2 交换反应标记5′端 121

3.11.3 双链3′→5′外切核酸酶 122

3.11.2 双链5′→3′末端外切核酸酶 122

3.12.2 S1核酸酶 123

3.12.1 Bal31核酸酶 123

3.12 内切核酸酶 123

3.12.4 微球菌核酸酶 124

3.12.3 绿豆核酸酶 124

3.13.1 核糖核酸酶A（RNA酶A） 125

3.13 核糖核酸酶 125

3.12.5 脱氧核糖核酸酶I（DNA酶I） 125

3.13.2 核糖核酸酶H 126

3.14.2 大肠杆菌DNA连接酶 127

3.14.1 T4噬菌体DNA连接酶 127

3.13.3 核糖核酸酶T1 127

3.14 DNA连接酶 127

3.16.1 基本方案 128

3.16 DNA片段的亚克隆 128

3.15 RNA连接酶 128

3.16.2 备择方案 凝胶块中DNA片段的连接 130

基本方案 DNA片段亚克隆 131

3.17 聚合酶链式反应构建重组DNA 131

3.18.1 基本方案1 用切口平移法制备生物素酰化的探针 135

3.18 非同位素探针的标记和比色检测 135

3.18.2 基本方案2 用随机寡核苷酸引物合成法制备生物素酰化探针 136

3.18.3 辅助方案 生物素酰化探针的比色法检测 137

3.18.4 备择方案 制备和检测地高辛标记的DNA探针 138

3.19.1 基本方案 生物素标记探针的化学发光检测 139

3.19 非同位素探针的化学发光检测 139

3.19.3 辅助方案 紫外光源的标化 142

3.19.2 备择方案 地高辛标记探针的化学发光检测 142

第4章 RNA的制备和分析 144

4.1.1 基本方案 145

4.1 从组织培养细胞中提取细胞质RNA 145

4.1.2 辅助方案 除去混杂的DNA污染 146

4.2.1 基本方案 从组织或培养细胞中一步法分离RNA 147

4.2 异硫氰酸胍法制备总RNA 147

4.2.2 备择方案1 CsCl法纯化从培养细胞中提取的RNA 148

4.2.3 备择方案2 CsCl纯化组织RNA 149

4.3 酚／SDS法制备植物RNA 150

4.4.1 基本方案1 从革兰氏阴性细菌中分离高质量的RNA 151

4.4 制备细菌RNA 151

4.4.2 基本方案2 从革兰氏阳性细菌分离RNA 153

4.5 poly(A)+RNA的制备 154

4.4.3 备择方案 从革兰氏阴性菌中快速分离RNA 154

4.6 用单链DNA探针进行mRNA的S1核酸酶作图分析 155

4.6.1 基本方案 用M13模板进行mRNA的S1作图 156

4.6.2 备择方案1 从双链模板合成单链探针 158

4.6.3 备择方案2 用寡核苷酸探针进行mRNA的定量S1作图分析 159

4.7.1 基本方案 160

4.7 核酸酶保护试验 160

4.6.4 辅助方案 S1核酸酶mRNA定量分析的实验对照 160

4.7.3 辅助方案2 模板DNA的制备 162

4.7.2 辅助方案1 RNA探针的提纯 162

4.8 引物延伸 163

4.9.1 基本方案 甲醛－琼脂糖凝胶电泳分离RNA的Northern杂交 165

4.9 RNA的Northern印迹和狭线杂交分析 165

4.9.2 备择方案1 经戊二醛／二甲基亚砜变性处理的RNA的Northern杂交 168

4.9.3 备择方案2 经狭线印迹固定的未分级RNA样品的Northern杂交 169

4.9.4 辅助方案 Northern Blot探针的除去 170

第5章 重组DNA文库的构建 172

5.1.2 亚基因组文库 174

5.1.1 代表性与随机性 174

5.1 基因组DNA文库概述 174

5.2 cDNA文库概述 175

5.1.3 基因组DNA文库载体 175

基本方案 176

5.3 噬菌体文库的扩增 176

基本方案 178

5.4 黏粒和质粒文库的扩增 178

第6章 重组DNA文库的筛选 179

6.1 噬菌体文库的铺平板和转移 181

6.2 黏粒及质粒文库的铺平板和转移 182

6.3.2 备择方案 在水溶液中杂交 184

6.3.1 基本方案 在甲酰胺溶液中杂交 184

6.3 应用DNA片段作探针 184

6.4.1 基本方案1 在氯化钠／柠檬酸钠溶液（SSC）中杂交 185

6.4 使用合成寡核苷酸作探针 185

6.4.2 基本方案2 在氯化四甲铵（TMAC）中杂交 186

6.4.3 辅助方案 混合寡核苷酸5′末端标记 187

6.6 黏粒和质粒克隆的纯化 189

6.5 噬菌体克隆的纯化 189

6.7.1 基本方案 用抗体筛选λgt11表达文库 190

6.7 在λ噬菌体噬斑中产生的融合蛋白的免疫筛选 190

6.7.2 备择方案 在抗体筛选之前用IPTG诱导融合蛋白表达 191

6.8 在杂交选择和翻译后进行的免疫筛选 192

6.9.1 YAC文库的构建 194

6.9 概述筛选YAC文库和分析YAC克隆的策略 194

6.9.3 基因座特异性PCR试验的设计 196

6.9.2 中心实验室的YAC文库筛选 196

6.9.4 分析独立的YAC克隆 197

6.10.1 基本方案1 含YAC的酵母菌株的培养和保存 198

6.10 对分离得到的YAC克隆的分析 198

6.9.5 YAC插入片段的亚文库的构建与分析 198

6.10.2 基本方案2 制备YACDNA进行Southern印迹分析 200

6.10.3 基本方案3 制备用于脉冲电场凝胶电泳的包埋于琼脂糖胶块中的酵母染色体 201

6.10.4 基本方案4 用PCR扩增法进行末端片段分析 202

6.10.5 备择方案 在细菌质粒载体中分析末端片段 205

6.10.7 基本方案5 制备高分子质量的含YAC的酵母DNA 207

6.10.6 辅助方案 设计和制备pUC19-ES和pUC19-HS亚克隆载体 207

6.10.8 基本方案6 制备和分析YAC插入片段的亚文库 209

7.0 DNA测序方法概述 210

第7章 DNA序列测定 210

7.0.1 双脱氧测序（Sanger法） 211

7.0.2 化学测序（Maxam-Gilbert法） 213

7.0.4 放射性标记测序反应的备择标记 215

7.0.3 双脱氧法或化学测序法的选择 215

7.1.1 双脱氧测序 217

7.1 DNA测序策略 217

7.1.2 化学测序 219

7.2.1 基本方案1 用外切酶Ⅲ构建单向缺失突变体 220

7.2 构建用于DNA测序的嵌套式缺失突变体 220

7.2.2 辅助方案1 用［α-35S］dNTP使DNA免于外切酶Ⅲ消化 224

7.2.3 基本方案2 用Bal31核酸酶构建嵌套式缺失突变体 225

7.2.4 辅助方案2 制备M13mp测序载体以亚克隆Bal31消化的DNA片段 229

7.3.1 基本方案1 制备单链M13噬菌体DNA 230

7.3 制备DNA测序模板 230

7.3.2 基本方案2 从小量裂解物中制备λ噬菌体DNA 231

7.3.3 基本方案3 小量制备用于双脱氧测序的双链质粒DNA模板 232

7.3.4 基本方案4 用于双脱氧测序的双链质粒DNA的碱变性 233

7.4 双脱氧法DNA测序 234

7.3.5 基本方案5 制备用于热循环测序质粒或噬菌体DNA 234

7.4.1 基本方案1 用测序酶进行标记／终止测序反应 235

7.4.3 备择方案2 使用TaqDNA聚合酶进行Sanger双脱氧测序 239

7.4.2 备择方案1 使用Mn2+的标记／终止反应 239

7.4.4 备择方案3 用5′末端标记引物一步法进行测序反应 240

7.4.5 基本方案2 用α－标记核苷酸进行热循环测序反应 241

7.4.7 备择方案5 使用荧光引物或荧光终止物进行循环测序 244

7.4.6 备择方案4 用5′末端标记引物进行热循环测序反应 244

7.5 化学发光双脱氧DNA测序法 246

7.5.1 基本方案 利用生物素标记引物的化学发光DNA测序法 248

7.5.2 备择方案1 链亲和素和生物素酰化碱性磷酸酶两步检测法（间接法） 250

7.5.3 备择方案2 用半抗原标记引物进行测序并用抗体碱性磷酸酶偶联物进行检测 251

7.6.1 基本方案 测序胶的灌制、电泳及处理 252

7.6 用于测序的变性凝胶电泳 252

7.6.2 备择方案1 缓冲液梯度测序胶 255

7.6.3 备择方案2 电解质梯度测序胶 256

7.7.1 序列数据的录入 257

7.7 DNA和蛋白质序列的计算机处理和分析 257

7.6.4 备择方案3 含甲酰胺的测序胶 257

7.7.2 序列数据的确证和组装 260

7.7.3 限制酶作图 263

7.7.4 核酸结构预测 264

7.7.5 寡核苷酸设计策略 265

7.7.6 蛋白质编码区的识别 267

7.7.7 同源性检索 268

7.7.8 向分子生物学提供的基因序列库及其他计算机资源 271

第8章 克隆化DNA的诱变 279

8.1 无需表型选择的寡核苷酸介导的诱变 280

8.2A 用简并寡核苷酸在小段DNA序列中产生大量突变 283

8.2B 基因合成：用互为引物的长段寡核苷酸合成目的序列 286

8.3.1 基本方案 287

8.3 区域特异性诱变 287

8.4.1 基本方案 用嵌套缺失体和互补寡核苷酸进行接头分区诱变 290

8.4 DNA的接头分区诱变 290

8.3.2 辅助方案 突变克隆的富集 290

8.4.2 备择方案 寡核苷酸介导的接头分区诱变 292

8.5.1 基本方案1 通过PCR引入限制酶切位点 293

8.5 利用聚合酶链反应（PCR）的定点诱变 293

8.5.2 基本方案2 利用PCR引入点突变 296

8.5.3 备择方案 通过连续PCR引入点突变 299

第9章 DNA导入哺乳动物细胞 300

9.1.1 基本方案 磷酸钙－DNA在HEPES中形成沉淀的转染方法 305

9.1 磷酸钙转染法 305

9.1.2 辅助方案 哺乳动物细胞的甘油／二甲基亚砜休克 306

9.1.3 备择方案 在BES中形成磷酸钙－DNA沉淀的高效转染方法 307

9.2.1 基本方案 DEAE－葡聚糖转染法的基本操作程序 308

9.2 利用DEAE－葡聚糖的转染 308

9.2.2 备择方案 样本实验：用以检测酶的结构／活性关系的转染 310

9.3.1 基本方案 电穿孔法转染哺乳动物细胞 311

9.3 电穿孔转染法 311

9.2.3 辅助方案 炭吸附胎牛血清 311

9.3.2 备择方案 植物原生质体细胞的电穿孔转染 312

9.4.1 基本方案 用脂质体介导短暂表达 313

9.4 脂质体介导的转染 313

9.5 被转染哺乳动物细胞的选择 314

9.4.2 备择方案 用脂质体进行稳定转染 314

9.5.1 基本方案1 哺乳动物细胞的稳定转染 316

9.5.2 基本方案2 哺乳动物细胞的选择标记 318

9.6 遗传报道基因系统概述 322

9.6.1 报道载体的设计 323

9.6.2 体外报道分子分析方法 326

9.6.3 体内报道分子分析方法 329

9.7A.1 基本方案1 CAT活性的色谱分析法 331

9.7A 报道基因活性的同位素分析方法 331

9.7A.3 备择方案2 CAT活性的相－抽提分析法 333

9.7A.2 备择方案1 原位裂解细胞的CAT分析方法 333

9.7A.4 基本方案2 人生长激素的放射免疫分析法 334

9.7B.1 基本方案1 萤火虫萤光素酶报道基因分析 336

9.7B 非同位素分析报道基因活性 336

9.7B.3 基本方案2 β－半乳糖苷酶报道基因的化学发光分析 337

9.7B.2 备择方案 冻融裂解的细胞的萤光素酶分析 337

9.8.1 反转录病毒生活周期 339

9.8 反转录病毒转导系统概述 339

10.2.7 备择方案5 在梯度凝胶中分离蛋白质 340

9.8.2 无复制能力的载体 341

9.8.3 有复制能力的载体 343

9.8.4 包装细胞系和病毒的产生 344

9.8.5 鼠反转录病毒 348

9.8.7 安全性问题 350

9.8.6 禽反转录病毒 350

9.9.1 基本方案1 将反转录病毒载体导入包装细胞系 351

9.9 建立特异的反转录病毒产毒细胞系 351

9.9.2 基本方案2 测定病毒滴度：高滴度产病毒细胞克隆的鉴定 353

9.10 制备高滴度反转录病毒上清的瞬时转染方法 355

9.9.3 备择方案 产毒克隆的快速评价 355

9.9.4 辅助方案 培养细胞的Xgal染色 355

9.10.1 基本方案1 将反转录病毒载体瞬时转染入293细胞系 356

9.10.2 辅助方案 293细胞的生长和保存 357

9.10.3 基本方案2 用反转录病毒上清感染贴壁细胞 358

9.10.5 基本方案3 用反转录病毒上清感染非贴壁细胞 359

9.10.4 备择方案1 旋转感染法感染贴壁细胞 359

9.10.6 备择方案2 共培养感染非贴壁细胞 360

9.10.7 备择方案3 旋转感染法感染非贴壁细胞 361

9.11.1 基本方案 用离心法制备和浓缩病毒原液 362

9.11 大规模制备和浓缩反转录病毒原液 362

9.11.2 备择方案1 用聚乙二醇沉淀及层析法浓缩病毒 363

9.12.1 基本方案 通过药物抗性的水平传播分析辅助病毒 364

9.11.3 备择方案2 用分子质量截留滤膜进行浓缩 364

9.12 反转录病毒原液中辅助病毒的检测 364

9.12.2 备择方案1 用原病毒检测具复制能力的反转录病毒 365

9.13.1 体外细胞感染 367

9.12.3 备择方案2 用反转录酶分析法检测辅助病毒 367

9.13 用反转录病毒在体外及体内感染细胞 367

9.13.2 在体内感染啮齿类动物 368

第10章 蛋白质分析 370

10.1.2 基本方案2 应用Bradford法测定蛋白浓度 377

10.1 蛋白浓度测定 377

10.1.1 基本方案1 应用A280来测定蛋白浓度 377

10.2 蛋白质的单向SDS凝胶电泳 378

10.2.1 基本方案1 变性（SDS）不连续凝胶电泳：Laemmli凝胶法 379

10.2.2 备择方案1 Tris-Tricine缓冲液系统的电泳 383

10.2.3 备择方案2 在无尿素条件下用Tris缓冲液分离多肽 385

10.2.4 备择方案3 连续SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 386

10.2.5 备择方案4 超薄凝胶的灌制和电泳 387

10.2.6 辅助方案1 一次灌制多块浓度均一的凝胶 388

10.2.8 辅助方案2 一次灌制多块梯度胶 393

10.2.9 基本方案2 在均一浓度的微型凝胶上电泳 395

10.2.10 辅助方案3 制备多块梯度胶 397

10.3.1 基本方案1 第1向凝胶（等电聚焦） 398

10.3 使用O'Farrell系统的双向凝胶电泳 398

10.3.2 基本方案2 第2向凝胶 400

10.3.3 极端碱性、酸性蛋白的等电聚焦 402

10.4 凝胶中蛋白的染色 403

10.3.5 辅助方案 组织来源的蛋白样品的溶解和制备 403

10.3.4 备择方案 小型凝胶两向电泳 403

10.4.2 基本方案2 银染法 404

10.4.1 基本方案1 考马斯亮蓝染色 404

10.4.3 备择方案 非氨盐银染法 405

10.4.4 基本方案3 快速银染法 406

10.5.1 基本方案1 用转移槽转印蛋白质 407

10.5 免疫印迹和免疫检测 407

10.4.5 辅助方案 凝胶拍照 407

10.5.2 备择方案1 用半干转移系统转印蛋白质 409

10.5.5 基本方案2 用第二抗体偶联物进行免疫检测 411

10.5.4 辅助方案1 转印后蛋白质的可逆染色 411

10.5.3 备择方案2 染色凝胶的印迹 411

10.5.6 备择方案3 用亲和素－生物素偶联的第二抗体进行免疫检测 413

10.5.7 基本方案3 用发色底物显迹 414

10.5.8 备择方案4 用发光底物显迹 415

10.6.1 基本方案1 脱盐（组分分离） 416

10.6 凝胶过滤层析 416

10.5.9 辅助方案2 膜的清洗和再使用 416

10.6.2 基本方案2 蛋白质的分级分离 421

10.6.3 基本方案3 分子质量的测定 425

10.6.4 辅助方案 柱校正 427

10.7.1 基本方案1 批式吸附和增加盐浓度的阶段梯度洗脱 429

10.7 离子交换层析 429

10.7.2 基本方案2 线性梯度洗脱的柱层析 432

10.7.3 辅助方案 进行小试确定离子交换层析的起始条件 435

10.8.1 基本方案 可溶性或膜结合抗原的分离 439

10.8 免疫亲和层析 439

10.8.2 备择方案1 抗原的批式纯化 441

10.9 金属螯合亲和层析 442

10.8.3 备择方案2 低pH洗脱抗原 442

10.9.1 基本方案 天然MCAC纯化对组氨酸加尾的可溶性融合蛋白 443

10.9.2 备择方案1 变性条件下用MCAC纯化带组氨酸尾的不溶性融合蛋白 445

10.9.4 辅助方案 NTA介质的再生 446

10.9.3 备择方案2 MCAC纯化蛋白的固相复性 446

10.10.1 基本方案1 5-500PMOL水平的反相肽分离 447

10.10 肽的反相分离 447

10.10.3 辅助方案 毛细管HPLC系统的装配 449

10.10.2 基本方案2 不超过于5 pmol的反相肽分离 449

10.11 通过表位标签纯化重组蛋白 450

基本方案 带表位标签重组蛋白的免疫沉淀 452

10.12.1 基本方案 用抗体－Sepharose偶联物免疫沉淀放射性标记抗原 454

10.12 免疫沉淀 454

10.12.2 辅助方案 制备抗体－Sepharose偶联物 455

10.12.4 备择方案2 用抗Ig抗体－Sepharose、蛋白A－或蛋白G-Sepharose或金黄色葡萄球菌（S.aureus）免疫沉淀放射性标记抗原 457

10.12.3 备择方案1 用抗Ig血清免疫沉淀放射性标记抗原 457

10.12.6 备择方案4 用抗体－Sepharose琼脂糖偶联物免疫沉淀非标记抗原 458

10.12.5 备择方案3 使用更剧烈的解离和洗涤条件的免疫沉淀 458

10.13 克隆化基因的体外转录和翻译 459

10.14 氨基酸代谢标记 461

10.14.1 基本方案 ［35S］标记甲硫氨酸对悬浮培养细胞的脉冲标记 462

10.14.3 备择方案2 ［35S］甲硫氨酸脉冲示踪标记细胞 463

10.14.2 备择方案1 贴壁细胞的［35S］甲硫氨酸脉冲标记 463

10.14.4 备择方案3 ［35S］甲硫氨酸的长期细胞标记 464

10.14.5 备择方案4 用其他放射性标记的氨基酸进行代谢标记 465

10.14.6 辅助方案 TCA沉淀法来测定所标记掺入量 466

10.15.1 基本方案1 测定在PVDF膜上样品的氨基酸序列 467

10.15 分离蛋白质用于微量序列分析 467

10.15.3 基本方案2 测定N端封闭蛋白质的内部序列 469

10.15.2 辅助方案 准备SDS-PAGE蛋白质样品 469

第11章 免疫学 472

11.1.1 基本方案 辣根过氧化物酶HRPO与抗体的偶联 474

11.1 酶与抗体的偶联 474

11.2 酶联免疫吸附分析（ELISA） 475

11.1.2 备择方案 碱性磷酸酶与抗体的偶联 475

11.2.1 基本方案 间接ELISA法检测特异性抗体 476

11.2.2 备择方案1 直接竞争ELISA法检测可溶性抗原 477

11.2.3 备择方案2 抗体夹心ELASA法检测可溶性抗原 479

11.2.4 备择方案3 双抗体夹心ELISA检测特异性抗体 480

11.2.5 备择方案4 直接细胞ELISA法检测细胞表面抗原 481

11.2.6 备择方案5 间接细胞ELISA法检测对表面抗原具有特异性的抗体 482

11.2.7 辅助方案1 正交连续稀释法确定最佳试剂浓度 483

11.2.8 辅助方案2 制备细菌裂解物抗原 484

11.3.1 基本方案1 单克隆抗体上清的制备 485

11.3 单克隆抗体上清液和腹水的制备 485

11.3.2 备择方案1 单克隆抗体上清的大量制备 486

11.3.3 备择方案2 大量制备杂交瘤或细胞系 487

11.3.4 基本方案2 含单克隆抗体的腹水的制备 488

11.4.1 基本方案 用蛋白A-Sepharose进行纯化 489

11.4 单克隆抗体的纯化 489

11.4.2 备择方案1 蛋白A-Sepharose的备择缓冲液系统 490

11.4.3 备择方案2 用抗原－Sepharose和抗鼠Ig-Sepharose进行纯化 491

11.5.1 基本方案 肌肉内注射免疫法 492

11.5 兔多克隆抗血清的制备 492

11.5.2 备择方案1 皮内注射免疫法 493

11.5.4 备择方案3 耳动脉放血 494

11.5.3 备择方案2 皮下注射免疫法 494

11.6.2 备择方案 用DEAE-Affi-GelBlue层析法分级分离IgG 495

11.6.1 基本方案 用硫酸铵沉淀IgG 495

11.6 从抗血清、腹水或杂交瘤上清液中纯化IgG抗体 495

11.7 免疫原性肽的选择 496

11.8.1 基本方案 通过化学偶联法用MBS将合成肽偶联到载体蛋白上去 498

11.8 抗肽抗体的制备 498

11.8.2 备择方案 用戊二醛将合成肽通过化学偶联法交联到载体蛋白质上 499

第12章 DNA－蛋白质相互作用 501

12.1.1 基本方案 核提取物的制备 503

12.1 从哺乳动物细胞中制备核提取物和细胞质提取物 503

12.1.2 辅助方案1 细胞核提取方法的优化 505

12.2 DNA结合蛋白在凝胶电泳中的迁移率变动分析 506

12.1.3 辅助方案2 细胞质（S-100）组分的制备 506

12.2.1 基本方案 迁移率变动分析 507

12.2.2 备择方案1 竞争迁移率变动分析 509

12.2.4 备择方案3 多元变动分析 510

12.2.3 备择方案2 抗体超变动分析 510

12.3.1 基本方案1 甲基化干扰分析法 511

12.3 甲基化干扰分析法和尿嘧啶干扰分析法 511

12.3.2 基本方案2 尿嘧啶干扰分析法 512

12.4 DNA酶I足迹分析法 514

12.4.1 基本方案 DNA酶I足迹分析法 515

12.4.2 辅助方案 用光密度及数值分析法决定蛋白质结合的平衡常数 517

12.4.3 辅助方案 粗制品的DNA酶I足迹分析法 519

12.5.1 基本方案 用溴脱氧尿苷（BrdU）取代的探针进行紫外交联 520

12.5 蛋白质与核酸的紫外交联 520

12.5.3 备择方案2 原位紫外交联 523

12.5.2 备择方案1 用非溴脱氧尿苷（BrdU）取代的探针进行紫外交联 523

12.6.1 基本方案 524

12.6 用生物素／链亲和素亲和系统纯化DNA结合蛋白 524

12.6.2 备择方案1 用微型柱进行纯化 525

12.6.3 备择方案2 用链亲和素－琼脂糖进行纯化 526

12.7.1 基本方案 用识别位点DNA筛选λgt11表达文库 527

12.7 编码DNA结合蛋白的cDNA的检测、纯化和鉴定 527

12.7.2 备择方案 干燥膜的变性／复性 529

12.7.3 辅助方案 从重组溶原菌中制备粗提物鉴定DNA结合蛋白的活性 530

基本方案 531

12.8 用体外合成的蛋白质分析DNA蛋白质相互作用 531

12.9.1 基本方案1 DNA亲和介质的制备 532

12.9 序列特异性DNA结合蛋白的亲和层析纯化 532

12.9.3 辅助方案1 用制备性凝胶电泳纯化寡核苷酸 535

12.9.2 备择方案 将DNA偶联于溴化氰活化的琼脂糖上 535

12.9.4 基本方案2 DNA亲和层析法 537

12.9.5 辅助方案2 非同位素竞争性DNA的选择和制备 539

12.10.1 基本方案 540

12.10 PCR辅助结合位点选择确定蛋白质－DNA序列特异性 540

12.10.2 备择方案 从迁移率变动凝胶中分离和分析结合的寡核苷酸 544

第13章 酿酒酵母 545

13.1 酵母菌培养基的制备 546

13.1.1 液体培养基 547

13.1.2 固体培养基 550

13.2 酵母菌的培养与操作 552

13.1.3 菌株的保存与复苏 552

13.2.4 基本方案4 影印平板检测酵母菌表型 553

13.2.3 基本方案3 细胞密度检测 553

13.2.1 基本方案1 液体培养基培养酵母菌 553

13.2.2 基本方案2 固体培养基培养酵母菌 553

13.2.6 基本方案6 二倍体细胞的孢子形成 554

13.2.5 基本方案5 二倍体细胞的构建 554

13.2.7 基本方案7 四分体的制备与剖分 555

13.2.8 辅助方案 解剖针的制作 557

13.2.9 备择方案 随机孢子分析 558

13.3.1 基本方案 乙基甲磺酸诱变 559

13.3 酵母菌细胞的诱变 559

13.3.2 备择方案 紫外光诱变 560

13.4 酵母菌的克隆载体与基因 561

13.4.1 质粒分类命名 563

13.4.2 精选的质粒和基因图谱 564

13.5 酵母菌表达载体 571

13.6.1 基本方案1 研究基因调控的LacZ融合载体 574

13.6 酵母菌载体与表达产物的检测 574

13.6.2 基本方案2 β－半乳糖苷酶在液体培养基中的表达与检测 575

13.7 将DNA导入酵母菌细胞中 576

13.6.3 备择方案 利用滤纸提取检测法筛选表达β－半乳糖苷酶的酵母菌落 576

13.7.1 基本方案 乙酸锂转化 577

13.7.2 备择方案1 原生质体转化 578

13.7.3 备择方案2 电穿孔转化 580

13.7.4 辅助方案 单链高分子量载体DNA的制备 581

基本方案 582

13.8 利用互补作用克隆酵母菌基因 582

13.9.2 基本方案2 质粒缺口修复 584

13.9.1 基本方案1 584

13.9 从酵母细胞中分离除去质粒 584

13.9.3 基本方案3 穿梭质粒 585

13.10.2 基因置换技术 587

13.10.1 基本方案1 整合性转化 587

13.10 克隆化酵母DNA的操作 587

备择方案1 PCR介导的基因一步破坏法 588

基本方案3 基因破坏一步法 588

基本方案2 整合性破坏 588

基本方案4 移换 590

13.10.3 基本方案5 一步整合置换产生修饰基因 591

13.10.5 基本方案6 通过铜诱导双重关闭技术产生条件表达的等位基因 592

13.10.4 备择方案2 通过移换产生修饰基因 592

13.11 酵母DNA的制备 594

13.11.2 备择方案 酵母染色体DNA的快速分离 595

13.11.1 基本方案 从酵母菌中快速分离质粒DNA 595

13.12.1 基本方案 热酸性酚抽提法制备酵母RNA 596

13.12 酵母菌RNA的制备 596

13.12.2 备择方案1 玻璃珠制备RNA 597

13.13 制备酵母蛋白抽提物 598

13.12.3 备择方案2 poly(A)+RNA的制备 598

13.13.1 基本方案 原生质球制备及裂解 599

13.13.2 辅助方案 差速离心法制备细胞核 600

13.13.4 备择方案2 液氮破细胞法 601

13.13.3 备择方案1 玻璃珠破细胞法 601

14.1 组织、胚胎及单细胞的固定、包埋及切片 603

第14章 原位杂交和免疫组织化学 603

14.1.1 基本方案 组织和胚胎的多聚甲醛固定及石蜡包埋 604

14.1.3 辅助方案1 成年小鼠的灌注 605

14.1.2 备择方案 悬浮及培养细胞的PFA固定 605

14.1.4 辅助方案2 蜡块中样品的切片 606

14.1.5 辅助方案3 预包被载玻片的处理 607

14.2 冰冻切片 608

14.2.1 基本方案 样品制备及切片 609

14.2.2 辅助方案1 用于原位杂交的冰冻切片的固定 611

14.3 细胞RNA的原位杂交 612

14.2.3 辅助方案2 组织固定和蔗糖灌注 612

14.3.1 基本方案 石蜡切片或细胞的杂交实验 613

14.3.2 备择方案 冰冻切片的杂交实验 616

14.3.3 辅助方案1 35S标记的核糖核酸探针和含硫探针竞争剂的合成 617

14.4.2 基本方案2 胶乳放射自显影 619

14.4.1 基本方案1 胶片放射自显影 619

14.3.4 辅助方案2 35S标记的双链DNA探针的合成 619

14.4 杂交探针的检测 619

14.4.3 辅助方案 放射自显影用稀释胶乳的制备 620

14.5.1 基本方案 吉姆萨（Giemsa）染色 621

14.5 放射自显影原位杂交玻片的复染和压片固定 621

14.5.2 备择方案1 苏木精／伊红染色 622

14.5.4 备择方案3 HOECHST染色法 623

14.5.3 备择方案2 甲苯胺蓝染色 623

14.6 免疫组织化学法 624

14.6.2 备择方案1 悬浮细胞的免疫荧光标记 626

14.6.1 基本方案1 单层生长细胞的免疫荧光标记 626

14.6.3 基本方案2 组织切片的免疫荧光标记 627

14.6.4 备择方案2 链亲和素－生物素结合物免疫荧光标记法 628

14.6.6 备择方案4 组织切片的免疫过氧化物酶标记 629

14.6.5 备择方案3 组织切片的免疫金标记 629

14.7.1 基本方案 荧光原位杂交 630

14.7 用非同位素进行原位杂交和检测 630

14.6.7 备择方案5 组织切片的免疫荧光双标记法 630

14.7.2 杂交信号的放大 632

14.7.3 非同位素标记探针的酶法检测 634

14.8.1 总体设计 637

14.8 低丰度核酸的检测：原位PCR和杂交 637

14.8.2 基本方案1 DNA和RNA靶序列的原位PCR扩增 640

14.8.3 备择方案 一步法反转录及扩增 643

14.8.4 基本方案2 ISPCR扩增的产物的杂交和检测 644

14.8.6 辅助方案2 在载玻片上制备原位PCR样品 648

14.8.5 辅助方案1 AES浸泡处理载玻片的制备 648

14.8.7 辅助方案3 用33P标记寡核苷酸探针 649

第15章 聚合酶链式反应（PCR） 651

基本方案 652

15.1 PCR扩增DNA：标准程序和优化 652

15.2.2 备择方案1 单引物重复扩增制备单链模板以用于双脱氧测序 658

15.2.1 基本方案1 不对称PCR产生的单链产物的双脱氧测序 658

15.2 利用PCR产物直接进行DNA序列测定 658

15.2.3 备择方案2 制备用于双脱氧测序的双链PCR产物 659

15.2.5 基本方案2 PCR产物的标记和化学测序 660

15.2.4 备择方案3 用λ噬菌体核酸外切酶消化双链PCR产物得到单链进行双脱氧测序 660

15.2.6 备择方案4 PCR产物的基因组测序 661

基本方案 662

15.3 通过PCR方法对微量DNA进行定量分析 662

15.4.1 基本方案 在最适条件下进行RNA的PCR扩增 665

15.4 PCR扩增RNA 665

15.4.2 备择方案1 避免长时间的共沉淀及退火步骤的方法 666

15.5 用于基因组测序及足迹分析的连接介导PCR 667

15.4.4 辅助方案 粗制RNA的快速提取 667

15.4.3 备择方案2 将cDNA直接用于扩增反应 667

15.5.1 基本方案 连接介导的单侧PCR 669

15.5.2 辅助方案1 从单层细胞制备基因组DNA以用于DMS足迹分析 672

15.5.3 辅助方案2 从悬浮细胞中制备用于DMS足迹分析的基因组DNA 675

15.5.4 辅助方案3 用于化学测序的基因组DNA的制备 676

15.6 利用单侧PCR（锚式PCR）进行cDNA扩增 677

15.6.1 基本方案1 扩增已知序列的下游（3′端）区段 679

15.6.2 基本方案2 扩增已知序列上游（5′端）区段 681

15.7.1 基本方案 产生T-A突出端 683

15.7 PCR产物的分子克隆 683

15.7.2 备择方案 产生半位点 684

15.8 通过PCR差异显示mRNA 686

第16章 蛋白质的表达 692

16.1 概述：蛋白质在大肠杆菌中的表达 693

16.1.2 特定的表达方案 694

16.1.1 用大肠杆菌进行基因表达的一般策略 694

16.1.3 基因表达的疑难分析 695

16.2.1 基本方案 用双质粒系统进行表达 696

16.2 T7噬菌体RNA聚合酶／启动子表达系统 696

16.2.2 备择方案1 质粒编码蛋白的选择性标记 698

16.2.3 备择方案2 通过M13噬菌体mGP1-2感染的表达 699

16.3 融合蛋白载体表达概述 700

16.4.1 基本方案1 用Xa因子进行融合蛋白的酶解 702

16.4 融合蛋白的酶解和化学裂解 702

16.4.3 备择方案1 用凝血酶进行融合蛋白的酶解 703

16.4.2 辅助方案 用Xa因子进行变性融合蛋白的裂解 703

16.4.4 备择方案2 与分离介质结合的GST融合蛋白的酶解 704

16.4.5 备择方案3 用肠激酶进行融合蛋白的酶解 705

16.4.6 基本方案2 用溴化氰对融合蛋白进行化学降解 706

16.4.8 备择方案5 低pH下水解融合蛋白进行化学裂解 707

16.4.7 备择方案4 用羟胺化学裂解融合蛋白 707

16.5 麦芽糖结合蛋白融合蛋白的表达及纯化 708

16.5.1 基本方案 MBP融合蛋白的构建、表达和纯化 709

16.5.2 辅助方案1 应用预实验鉴定MBP融合蛋白的特性 711

16.5.4 辅助方案2 离子交换层析纯化裂解蛋白 713

16.5.3 备择方案 从外周胞质中纯化融合蛋白 713

16.5.5 辅助方案3 亲和层析纯化裂解蛋白 714

16.6 谷胱甘肽－S－转移酶融合蛋白的表达及纯化 715

16.7.1 基本方案 硫氧还蛋白融合蛋白的构建和表达 718

16.7 硫氧还蛋白融合蛋白的表达和纯化 718

16.7.2 辅助方案1 用弗氏细胞压碎器裂解大肠杆菌 721

16.7.4 辅助方案3 用热处理纯化硫氧还蛋白融合蛋白 723

16.7.3 辅助方案2 硫氧还蛋白融合蛋白的渗透性释放 723

16.8 杆状病毒表达系统的概述 724

16.8.1 杆状病毒表达系统 725

16.8.3 用杆状病毒表达系统超量表达蛋白的步骤 726

16.8.2 昆虫细胞中蛋白质的翻译后修饰 726

16.8.4 选择杆状病毒转移载体 727

16.8.5 选择杆状病毒DNA 729

16.8.6 用于杆状病毒表达系统的试剂、溶液和设备 730

16.9.1 基本方案1 昆虫细胞的保存和培养 731

16.9 昆虫细胞培养的保存及重组杆状病毒的产生 731

16.9.2 基本方案2 用线性化杆状病毒DNA共转染昆虫细胞 733

16.9.3 备择方案 用野生型杆状病毒DNA共转染产生重组病毒 734

16.9.4 基本方案3 杆状病毒毒种贮液的制备 737

16.9.5 基本方案4 用蚀斑试验测定病毒贮液的滴度 738

16.10.1 基本方案1 用于最初分析的小规模表达 740

16.10 杆状病毒系统表达和纯化重组蛋白 740

16.10.2 辅助方案1 蛋白质生产高峰期的确定 741

16.10.3 辅助方案2 重组蛋白质的代谢标记 742

16.10.4 基本方案2 重组蛋白质的大规模生产 743

16.10.5 基本方案3 含有多聚组氨酸（6×His）标签重组蛋白的纯化 744

16.10.6 备择方案 含有GST标签重组蛋白的纯化 745

16.11.1 病毒介导的基因转移 747

16.11 概述：蛋白质在哺乳动物细胞中表达 747

16.11.3 DNA的稳定转染 748

16.11.2 短暂表达 748

16.11.4 转染DNA的扩增 749

16.11.7 问题的发现与解决 750

16.11.6 表达系统的选择 750

16.11.5 表达载体 750

16.12 用COS细胞短暂表达蛋白质 751

16.13 痘苗病毒表达系统概述 753

16.13.1 痘苗病毒的生活周期 754

16.13.3 痘苗病毒表达载体系统 755

16.13.2 痘苗病毒感染的效应 755

16.13.5 痘苗病毒的安全性问题 756

16.13.4 痘苗病毒载体表达基因的步骤 756

16.14.1 基本方案1 贴壁细胞的培养 757

16.14 细胞系和痘苗病毒贮液的制备 757

16.14.2 基本方案2 悬浮细胞的培养 759

16.14.3 基本方案3 痘苗病毒贮液的制备 760

16.14.5 基本方案4 鸡胚成纤维细胞的制备 761

16.14.4 辅助方案1 蚀斑分析测定痘苗病毒贮液的滴度 761

16.14.6 基本方案5 MVA病毒贮液的制备 763

16.14.7 辅助方案2 用免疫染色法滴定MVA病毒 764

16.15.1 基本方案1 痘苗载体转染痘苗病毒感染的细胞 765

16.15 重组痘苗病毒的制备 765

16.15.2 辅助方案1 痘苗病毒的纯化 769

16.15.3 辅助方案2 痘苗病毒DNA的提取 771

16.15.4 基本方案2 筛选重组病毒蚀斑 772

16.15.5 基本方案3 蚀斑扩增 774

16.15.6 基本方案4 重组MVA的活体免疫染色 775

16.15.7 辅助方案3 用刀豆蛋白A包被组织培养板 776

16.16 重组痘苗病毒及其产物的鉴定 777

16.16.1 基本方案1 应用PCR方法检测痘苗病毒 778

16.16.2 基本方案2 应用Southern杂交检测痘苗病毒DNA 780

16.16.3 基本方案3 应用斑点杂交检测痘苗病毒DNA 781

16.16.4 备择方案 应用斑点印迹检测表达的蛋白 782

16.16.5 基本方案4 应用免疫印迹检测表达的蛋白 782

16.16.6 基本方案5 应用免疫沉淀检测表达的蛋白 784

16.17 用痘苗病毒／T7RNA聚合酶系统表达基因 784

16.17.1 基本方案1 重组痘苗病毒（vTF7-3）感染后的脂质体转染 785

16.17.2 基本方案2 两种重组痘苗病毒共感染细胞 787

16.17.3 基本方案3 单病毒感染OST7-1细胞 788

16.17.4 基本方案4 利用VOTE系统进行基因表达 789

16.17.5 辅助方案 脉冲标记检测表达的蛋白 791

16.18 自主调节的四环素控制基因的诱导表达系统 792

16.18.1 基本方案 磷酸钙介导的pTet-tTAK稳定转染NIH3T3细胞和四环素调控的靶质粒 792

16.18.2 辅助方案 分析目的基因的蛋白质表达 796

16.18.3 转基因鼠的细胞或尾巴DNA中tTA基因的PCR检测 796

16.18.4 转基因鼠的细胞或尾巴DNA中tTA基因Southern印迹检测 797

第17章 蛋白质磷酸化的分析 798

17.1 蛋白质磷酸化概述 798

17.2 培养细胞用32Pi标记和用于免疫沉淀的细胞裂解物的制备 799

17.2.1 基本方案 培养细胞的32Pi标记和温和去污剂裂解法 800

17.2.2 备择方案 SDS煮沸法裂解细胞 801

17.3 磷酸氨基酸分析 802

17.3.1 基本方案 磷酸氨基酸的酸水解和双向电泳分析 802

17.4 分析非标记蛋白质的磷酸化作用 806

17.4.1 基本方案1 用抗磷酸酪氨酸抗体和125I标记蛋白A进行免疫印迹分析 806

17.3.2 备择方案 碱处理提高转移至滤膜上的磷酸化酪氨酸和磷酸苏氨酸的检测 806

17.4.2 备择方案 用增强化学发光法（ECL）检测结合的抗体 807

17.4.3 基本方案2 磷酸酶消化法鉴定磷酸化的蛋白质 808

17.5 酶法检测磷酸化作用 810

17.5.1 基本方案1 用非特异酸性磷酸酶消化磷酸蛋白质 810

17.5.2 备择方案1 用非特异碱性磷酸酶消化磷酸蛋白质 811

17.5.3 基本方案2 用丝氨酸／苏氨酸磷酸酶消化磷酸蛋白质 811

17.5.4 备择方案2 用酪氨酸磷酸酶消化磷酸蛋白质 812

17.5.5 辅助方案离解32P的测量和确定 812

17.6 用外源性底物分析蛋白激酶 813

17.6.1 基本方案1 环磷酸核苷依赖性蛋白激酶的分析 815

17.6.2 基本方案2 蛋白激酶C异构体的分析 816

17.6.3 基本方案3 用β－酪蛋白进行酪蛋白激酶的分析 816

17.6.4 备择方案 用多肽底物进行酪蛋白激酶的分析 817

17.6.5 基本方案4 Ca2+／钙调蛋白－依赖性激酶的分析 818

17.6.6 基本方案5 酪氨酸激酶的分析 818

17.6.7 基本方案6 在凝胶中直接进行激酶的分析 819

17.6.8 辅助方案1 用于激酶分析的细胞裂解方案 821

17.6.9 辅助方案2 三氯乙酸沉淀法测定放射性物质的掺入率 821

17.6.10 辅助方案3 P81磷酸纤维素膜的吸附 822

17.7 研究蛋白磷酸化的渗透策略 823

17.7.1 基本方案 利用渗透化细胞进行蛋白磷酸化的分析 824

17.7.2 制备用于蛋白磷酸化电泳分析的天然细胞样品 826

17.7.3 备择方案1 用于SDS-PAGE的天然细胞样品制备 826

17.7.4 备择方案2 制备用于等电聚焦的天然细胞样品 827

18.1 用BLAST程序组进行序列相似性搜索 828

18.1.1 BLAST程序组和说明文件 828

第18章 生物信息学 828

18.1.2 BLAST概述 829

18.1.3 BLAST搜索的举例 832

18.1.4 搜索策略 846

18.1.5 附录A：BLAST参数 849

18.1.6 附录B：序列标识的句法 849

第19章 蛋白质相互作用的分析 851

19.1 利用相互作用阱／双杂合系统确定相互作用的蛋白质 854

19.1.1 基本方案1 鉴定诱饵蛋白的特性 854

19.1.2 基本方案2 相互作用蛋白的捕获 861

19.1.3 备择方案1 相互作用阱的快速筛选 867

19.1.4 备择方案2 通过相互作用交配进行捕获实验 868

19.1.5 辅助方案1 用于免疫印迹分析的蛋白质提取物的制备 871

19.1.6 辅助方案2 制备鲑精载体DNA 871

19.2 与GST融合蛋白结合的蛋白质的亲和纯化 873

19.2.1 GST融合蛋白的亲和纯化 873

19.2.2 辅助方案 E.coli提取物的制备 875

19.3 基于噬菌体表达克隆来确认相互作用蛋白质 876

19.3.1 设计策略 877

19.3.2 基本方案 相互作用克隆 877

附录 881

附录1 试剂和溶液 881

附录2 标准测量值和数据 999

附录3 生物化学和分子生物学常用技术 1018

附录3A 放射自显影 1018

附录3B 玻璃器皿的硅化 1020

附录3C 透析与超滤 1021

附录3D 用吸收光谱法和荧光光谱法定量DNA和RNA 1026

附录3E 通过沉默突变引入限制性酶切位点 1028

附录3F 哺乳动物细胞组织培养技术 1031

附录3G 安全使用放射性同位素 1038

附录3H 分子生物学家的统计学：组比较 1047

附录4 试剂和设备的供应商 1069

附录5 参考文献 1091

索引 1100