医学分子生物学实验技术 第2版PDF电子书下载

绪论 1

一、分子生物学技术的历史和意义 1

二、医学分子生物学实验设计思路 3

三、分子生物学实验实施 6

第一章 聚合酶链反应 9

第一节PCR技术概述 9

一、PCR技术的建立和基本原理 9

二、PCR的反应体系 10

三、PCR反应基本步骤 12

第二节PCR的引物设计和条件优化 12

一、PCR引物的设计 12

二、PCR反应条件的优化 13

第三节PCR产物的鉴定方法 14

第四节PCR的基本类型及应用 16

一、PCR技术的主要类型 16

二、PCR技术的用途 23

第五节 实时定量PCR 25

一、实时定量PCR技术的原理 25

二、应用于实时定量PCR中的荧光探针与荧光染料 26

三、实时定量PCR的实验流程 29

四、实时定量PCR常见问题及优化方案 29

五、实时定量PCR技术在医学上的应用 30

第二章DNA体外重组 33

第一节DNA体外重组的基本流程 33

一、基本流程 33

二、关键工具酶 33

第二节 载体的选择及准备 37

一、载体及其基本特性 37

二、载体图谱 40

三、载体的选择 41

第三节 目的DNA片段的获取 43

一、获取DNA片段的方法选择 43

二、DNA片段末端的处理 45

第四节DNA片段与载体的连接 45

一、DNA片段与载体的连接方式 45

二、连接反应时需要考虑的一些因素 47

三、平端连接条件的优化 48

第五节 重组DNA转化宿主细胞 49

一、宿主细胞的选择 49

二、大肠埃希菌感受态制备 51

三、重组DNA分子转化大肠埃希菌 51

第六节 重组DNA的克隆筛选及鉴定 52

第三章DNA序列分析技术 55

第一节 常规DNA序列测定的原理 55

一、双脱氧测序法的原理 56

二、Maxam-Gilbert化学降解法测序原理 56

三、常规DNA测序的用途 57

第二节 自动激光荧光DNA测序——第一代测序技术 58

一、自动激光荧光DNA测序基本原理 58

二、自动激光荧光DNA测序程序 60

三、自动激光荧光DNA测序注意事项 62

第三节 其他DNA序列分析新技术 64

一、焦磷酸测序法 64

二、第二代测序技术——循环芯片测序法 65

三、第三代测序技术——单分子测序技术 68

第四章 基因突变技术 72

第一节 体外基因突变和鉴定 72

一、体外基因突变的原理和应用 72

二、体外基因突变的策略和步骤 73

第二节 细胞和动物的基因诱变和鉴定 77

一、利用ENU进行大规模基因诱变 77

二、利用转座子进行大规模基因诱变 79

第五章 核酸分子杂交 83

第一节 核酸探针及其标记 83

一、探针的种类及其选择 83

二、核酸标记物及其选择 84

三、核酸探针的标记方法 86

四、标记探针的纯化 90

第二节Southern印迹杂交 91

一、固相支持物与印迹方法的选择 91

二、Southern印迹杂交基本过程 93

三、Southern印迹杂交的注意事项 95

第三节Northern印迹杂交 96

一、Northern印迹杂交基本过程 96

二、Northern印迹杂交注意事项 97

第四节 其他核酸分子杂交 98

一、斑点杂交与狭缝印迹杂交 98

二、原位杂交 99

三、液相分子杂交 101

第六章 外源基因在原核细胞的表达 104

第一节 常用表达系统及其选择 104

一、大肠埃希菌表达系统 104

二、芽胞杆菌表达系统 108

三、链霉菌表达系统 108

第二节 外源基因的表达和鉴定 109

一、蛋白质在原核细胞中的表达特点 109

二、包涵体的形成、变性与复性 110

三、蛋白质在原核细胞表达的调控 111

四、外源基因在原核细胞中表达的鉴定 112

第三节 外源基因表达条件和优化 112

一、表达载体的优化设计与选择 112

二、增加mRNA的稳定性 113

三、提高外源蛋白的稳定性 113

四、选择合适的宿主菌 114

第四节 外源基因原核表达的基本操作 114

一、获得目的基因并克隆入原核表达载体 115

二、工程菌的构建 115

三、产物的表达与鉴定 116

四、样品的检定 116

第七章 外源基因在真核细胞中的表达 118

第一节 真核表达载体及宿主 118

一、常用表达系统及其特点 118

二、外源基因在真核细胞中表达的主要方式 118

三、外源基因在真核细胞中表达的鉴定 119

第二节 真核细胞基因导入方法 119

一、物理方法 119

二、化学方法 119

三、病毒感染法 120

第三节 外源基因在酵母细胞中的表达 120

一、常用的酵母细胞表达载体 120

二、酵母细胞表达外源蛋白质的主要方法 121

第四节外源基因在昆虫细胞中的表达 123

一、常用的昆虫表达系统 124

二、昆虫细胞表达外源蛋白质的主要方法 124

第五节外源基因在哺乳动物细胞中的表达 125

一、常用的哺乳动物细胞表达载体 126

二、哺乳动物细胞表达外源蛋白质的主要方法 128

第八章 蛋白质的分离纯化 131

第一节 蛋白质分离纯化的基本原则 131

第二节生物样品的预处理 133

一、机械破碎法 133

二、超声振荡法 133

三、反复冻融法 133

四、表面活性剂裂解及酶解法 133

第三节 蛋白质样品的粗分离 134

一、离心分离 134

二、透析和超滤 135

三、沉淀 136

第四节 蛋白质的层析纯化 137

一、凝胶过滤层析 137

二、离子交换层析 140

三、亲和层析纯化 143

四、疏水作用层析 145

第五节 蛋白质的电泳分离和鉴定 147

一、聚丙烯酰胺凝胶电泳 147

二、等电聚焦电泳 149

三、双向聚丙烯酰胺凝胶电泳 151

第六节 纯化蛋白质的后期处理 151

一、纯化蛋白质的复性 151

二、纯化蛋白质的脱盐和浓缩 152

三、纯化蛋白质的干燥和保存 153

第七节 蛋白质分离纯化的综合策略 153

一、基于纯化目的的策略 153

二、基于原料来源的策略 153

三、基于重组蛋白的纯化策略 154

第九章 蛋白质的定性定量分析 156

第一节 蛋白质分子量的测定 156

一、SDS-PAGE法测定蛋白质的相对分子量 156

二、凝胶过滤层析法测定蛋白质相对分子量 158

三、质谱法测定蛋白质精确分子量 159

第二节 蛋白质的等电点测定 160

一、等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的原理 160

二、等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的操作 160

第三节 蛋白质总含量测定 161

一、凯氏定氮法 162

二、Lowry法 162

三、二喹啉甲酸法 164

四、考马斯亮蓝法 165

五、紫外光谱吸收法 165

六、其他方法 166

第四节 特定蛋白质的含量测定 167

一、细胞可溶性蛋白的含量测定 167

二、细胞分泌蛋白的含量测定 175

三、膜蛋白的含量测定 177

第五节 蛋白质半衰期测定 178

一、脉冲追踪标记法 178

二、放线菌酮阻断法 180

第十章 蛋白的化学修饰分析 182

第一节 蛋白磷酸化分析 182

一、放射性核素示踪法用于蛋白磷酸化分析 183

二、抗磷酸化氨基酸抗体用于蛋白磷酸化分析 187

三、蛋白磷酸化的规模化分析 188

第二节 蛋白糖基化分析 189

一、酶解释放法鉴定糖蛋白 190

二、糖基化抑制剂用于鉴定糖蛋白 192

三、凝集素结合法鉴定糖蛋白 193

四、单糖放射性核素示踪法 194

第三节 其他蛋白共价修饰分析 194

一、蛋白泛素化分析 194

二、组蛋白的乙酰化和甲基化分析 197

第十一章 蛋白质的空间结构分析 199

第一节 蛋白质的一级结构分析 199

一、Edman降解法测序 199

二、质谱测序 200

第二节 蛋白质的二级结构分析 201

一、圆二色光谱 201

二、傅里叶变换红外光谱 202

第三节 蛋白质的晶体空间结构解析 202

一、基本原理 203

二、晶体结构解析过程 204

第四节 蛋白质的液相空间结构解析 205

一、蛋白质样品的准备 206

二、NMR实验及蛋白质化学位移指认 207

三、蛋白质溶液结构计算 208

第五节 蛋白质空间结构的预测 210

一、蛋白质二级结构预测 210

二、蛋白质三级结构预测 211

第六节 蛋白质的分子结构对接 212

一、蛋白质分子对接软件简介 212

二、蛋白质分子对接软件应用示例 212

第十二章 蛋白质相互作用研究技术 216

第一节 酵母双杂交法 216

一、酵母双杂交系统的基本原理和用途 216

二、酵母双杂交的主要实验步骤 218

三、酵母双杂交系统中常见问题与解决方案 221

四、逆双杂交系统和三杂交技术 222

第二节 标签融合蛋白结合实验 223

一、标签融合蛋白结合实验基本步骤 224

二、标签融合蛋白结合实验常见问题的解决与改进 224

第三节 免疫共沉淀分析 225

一、基本原理和主要步骤 225

二、几种特殊的免疫共沉淀技术 226

三、免疫共沉淀常见问题及解决办法 227

第四节 物理学方法研究蛋白-蛋白相互作用 228

一、荧光共振能量转移技术 229

二、共振光散射技术和表面等离子共振技术 231

三、共定位荧光染色技术 233

第五节 蛋白-蛋白相互作用预测方法 236

第十三章 蛋白质组学研究相关技术 238

第一节 蛋白质组双向凝胶电泳-质谱研究技术 239

一、双向凝胶电泳 239

二、MALD I-TOF质谱鉴定蛋白质 241

第二节基于多维层析-质谱的蛋白质组研究策略 244

一、蛋白质样本制备与酶解 245

二、肽混合物层析分离 245

三、电喷雾串联质谱 246

四、多维层析分离技术的新进展 248

第三节 定量蛋白质组学研究技术 248

一、荧光双向差异凝胶电泳 248

二、细胞培养氨基酸代谢稳定核素标记技术 249

三、核素辅助多重化学标记技术 250

四、无标记定量技术 251

五、质谱多反应监测绝对定量技术 251

第十四章 基因表达谱分析 254

第一节 基因表达谱分析的基本方法 254

一、基因芯片技术 254

二、基因表达系列分析 255

三、基因测序技术 256

第二节基因芯片的原理及应用 257

一、基因芯片的工作原理 257

二、基因芯片技术的基本流程 257

三、基因芯片的应用 261

第三节基因芯片的数据挖掘 262

一、生物信息学数据库 263

二、基因芯片数据挖掘的常用方法 264

第四节蛋白质芯片的原理及应用 265

一、蛋白质芯片的原理和实验流程 266

二、蛋白质芯片的分类及应用 267

第十五章 基因转录调控分析 269

第一节转录调节蛋白与DNA的结合分析 269

一、凝胶迁移或电泳迁移率实验 269

二、染色质免疫沉淀技术 272

第二节 启动子转录活性分析 275

一、报告基因技术的原理和应用 275

二、常用的报告基因 275

三、主要操作步骤 277

第三节DNA甲基化分析 278

一、甲基化特异性PCR 279

二、亚硫酸盐修饰后基因组测序 281

三、DNA甲基化检测的其他方法 282

第四节 芯片技术在基因表达调控研究中的应用 283

一、染色质免疫共沉淀-芯片技术 283

二、染色质免疫共沉淀-序列分析技术 284

第十六章 非编码RNA研究策略与方法 285

第一节miRNA的研究策略及相关技术 285

一、miRNA的发现与克隆 286

二、miRNA定量检测方法及其选择 286

三、miRNA靶基因的预测与证实 290

四、miRNA功能研究 292

第二节siRNA的设计与应用 295

一、应用siRNA的目的与原理 295

二、siRNA的设计与合成 296

三、siRNA的体内外递送方式 297

第十七章 疾病相关基因的鉴定和分析 299

第一节 鉴定和分析疾病相关基因的策略 299

一、疾病相关基因鉴定的基本原则 299

二、DNA标记 299

三、连锁分析 299

四、关联分析 300

五、动物模型 300

第二节 基因分型 301

一、SNP分型 302

二、STR分型 303

三、拷贝数目差异分型 304

第三节 突变基因的检测 306

一、以PCR为基础的检测方法 306

二、以核酸杂交为基础的检测方法 306

第十八章 遗传修饰动物 309

第一节 小鼠实验的一般要求 309

一、小鼠实验室的建立 309

二、小鼠的基本饲养条件 310

三、小鼠的日常管理 310

第二节 转基因小鼠 310

一、转基因载体的构建 311

二、受精卵的显微注射和移植 312

三、转基因小鼠的鉴定和进一步培育 316

四、转基因小鼠的表型分析 317

第三节 基因剔除小鼠 317

一、基因剔除载体的设计和构建 318

二、ES细胞的培养和在ES细胞进行基因剔除 320

三、ES细胞注射入囊胚和囊胚的移植 324

四、基因剔除小鼠的基因型和表型分析 325

第十九章 基因功能的研究策略 327

第一节 从分子水平研究基因产物的功能特点 327

一、应用计算机分析预测蛋白质功能 327

二、通过细胞内定位分析基因表达产物的可能功能 328

三、基因表达的定性、定量分析 328

四、通过定点突变分析蛋白质的功能 329

五、确定相互作用分子 330

第二节 从细胞水平研究基因产物的作用机制 330

一、表达、纯化基因产物 330

二、在细胞内转染表达基因以研究基因的功能 331

三、通过降低基因的表达水平分析基因表达产物在细胞中的作用 331

四、通过下游分子验证基因表达产物的功能 332

第三节 从整体水平研究基因产物的生物学效应 333

一、基因表达产物的体内分布特征 333

二、基因在生理或病理过程中的表达分析 333

三、基因敲除与敲入 333

四、体内表达基因 334

附录 335

附录Ⅰ分子生物学实验设计中的常见错误 335

附录Ⅱ分子生物学实验微量操作技巧 339

附录Ⅲ分子生物学实验教学实施方案 343

实验BCA法测定蛋白质的含量 343

实验二 蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 344

实验三 血清清蛋白、Y-球蛋白的分离纯化 345

实验四 组织DNA与RNA的分离与提取 348

实验五 碱裂解法提取质粒 DNA 349

实验六 紫外分光光度法测定核酸含量 350

实验七 聚合酶链反应 350

实验八DNA重组 351

实验九 蛋白质印迹 353

附录Ⅳ分子生物学实验资料参考 356

英中文名词对照索引 375