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第一篇 光学分析法 1

第一章 比色分析法 1

1.1 基本原理 1

1.1.1 光是电磁波 1

1.1.2 色光的互补 2

1.1.3 基本定律 2

1.1.3.1 朗伯定律 3

1.1.3.2 比耳定律 4

1.1.3.3 朗伯-比耳定律 4

1.1.4 比色分析法常用符号及其意义 4

1.1.5 运算公式 6

1.2 比色分析的条件 7

1.2.1 显色 7

1.2.1.1 显色反应的类型 7

1.2.1.2 显色剂的选择 8

1.2.1.3 影响显色的因素 9

1.2.2 入射光 10

1.2.3 干扰物质与干扰的排除 11

1.2.4 溶液的浓度 11

1.3 比色分析定量方法 12

1.3.1 标准系列法 12

1.3.2 等色法(平衡法) 12

1.3.3 消光-浓度工作曲线法 12

1.3.4 差示法 13

1.3.5 催化比色法 14

1.3.6 比色滴定法 14

1.4 光电比色计 15

1.4.1 光电比色计的工作原理 15

1.4.2 光电比色计的主要部件 16

1.4.2.1 光源 16

1.4.2.2 滤光片 16

1.4.2.3 比色槽 17

1.4.2.4 光电池 18

1.4.2.5 检流计 19

1.4.3 国产581-G型光电比色计 21

1.5 比色分析的误差 22

1.5.1 不符合朗伯--比耳定律 22

1.5.2 实验条件不一致 23

1.5.3 入射光强度不稳定或单色性太差 23

1.5.4 读数误差 24

第二章 分光光度法 27

2.1 基本理论 27

2.1.1 光谱的类型 27

2.1.1.1 发射光谱 27

2.1.1.2 吸收光谱 27

2.1.2 吸收光谱曲线 28

2.1.3 产生吸收光谱的机理 29

2.1.4 发色团和助色团 31

2.2 影响吸收光谱的几种因素 32

2.2.1 温度 33

2.2.2 溶剂 34

2.2.2.1 对曲线细微结构的影响 34

2.2.2.2 对n→π跃迁的影响 35

2.2.2.3 对π→π跃迁的影响 35

2.2.3 pH值 37

2.2.4 溶液浓度 38

2.2.5 狭缝宽度 38

2.2.6 背景吸收 39

2.3 定性分析 39

2.3.1 定性鉴定 39

2.3.2 纯度鉴定 41

2.3.3 结构分析 41

2.4 定量分析 42

2.4.1 单一物质的定量分析 42

2.4.2 混合样品的定量分析 42

2.4.2.1 吸收光谱不重叠的混合物定量方法 42

2.4.2.2 吸收光谱重叠的混合物定量方法 42

2.4.3 差光谱分析 43

2.4.4 消化系数计算法 44

2.4.5 络合物组成的测定 45

2.5 分光光度计 45

2.5.1 分光光度计的一般构造 46

2.5.2 分光光度计的主要部件 47

2.5.2.1 光源 47

2.5.2.2 单色器 47

2.5.2.3 比色杯 51

2.5.2.4 光电变换元件 52

2.5.2.5 检测单元 53

2.5.3 分光光度计的主要性能指标 55

2.5.4 紫外分光光度计的进展 55

2.5.4.1 双光束分光光度计 55

2.5.4.2 双波长分光光度计 56

2.5.4.3 紫外检测器 56

第三章 荧光分析法 58

3.1 前言 58

3.2 荧光的产生 61

3.3 荧光分析的根据--荧光强度 63

3.4 荧光效率 65

3.5 影响荧光强度的因素 67

3.5.1 pH值对荧光的影响 68

3.5.2 温度对荧光的影响 69

3.5.3 溶剂对荧光的影响 69

3.5.4 激发光对荧光的影响 71

3.5.5 荧光污染的影响 71

3.5.6 自吸收和内滤效应的影响 71

3.5.7 稀样品溶液的影响 73

3.5.7.1 氧化作用 73

3.5.7.2 光分解 73

3.5.7.3 表面吸附 73

3.5.8 荧光熄灭的影响 74

3.6 荧光分析的仪器 75

3.6.1 光源 75

3.6.2 滤光片和单色器 77

3.6.3 样品池(盛液杯) 79

3.6.4 检测器 79

3.6.5 光电荧光计 80

3.6.5.1 单光电池光电荧光计 80

3.6.5.2 双光电池补偿式光电荧光计 80

3.6.5.3 日本Shimadzu Kotaki UM型微量荧光计 81

3.6.5.4 国产930型荧光光度计 81

3.6.5.5 国产DF-01型数字显示式荧光测定仪 82

3.6.6 荧光分光光度计 83

3.7 荧光分析的常用方法 84

3.8 荧光分析的应用--具体方法举例 85

3.8.1 糖类的测定 85

3.8.2 乙醛酸(二羟醋酸)的测定--血，(尿和细菌抽提液中乙醛酸的测定 87

3.8.3 维生素A的测定 88

3.8.4 硫胺素和抗硫胺素的测定 89

3.8.5 维生素D的测定 91

3.8.6 胆碱和乙酰胆碱的测定 91

3.8.7 胆固醇和胆固醇酯的测定 92

3.8.8 氢化可的松(皮质醇)及其他皮质类固醇的测定 92

3.8.9 肾上腺素和去甲肾上腺素的测定 93

3.8.10 谷氨酰胺和天冬酰胺的测定 94

3.8.11 基于赖氨酸的含量对组蛋白的测定 96

3.8.12 谷胱甘肽的测定 96

3.8.13 组胺的测定 97

3.8.14 组织中蛋白酶的测定 97

3.8.15 组织蛋白酶B的测定 98

3.8.16 β-葡萄苷酸酶的测定 98

3.8.17 5′-核苷酸磷酸二酯酶的测定 98

3.8.18 半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的测定 99

3.8.19 核糖核酸酶的测定 99

3.8.20 DNA和RNA的测定 100

3.8.21 腺嘌呤及其衍生物的测定 103

第二篇 层析法 104

第一章 层析概论 104

1.1 发展简史 104

1.2 层析法中的一些术语 105

1.3 层析法的分类 106

1.3.1 根据分离的原理不同进行分类 106

1.3.2 根据流动相的不同分类 106

1.3.3 根据支持物的装填方式分类 107

1.4 层析法理论概述 107

1.4.1 分配定律 107

1.4.2 分配层析的机理 108

1.4.3 塔板理论 110

1.5 层析法的发展趋势 113

第二章 纸层析 115

2.1 纸层析的基本原理 115

2.1.1 纸层析的机理 115

2.1.2 Rf值 115

2.1.3 物质的化学结构与Rf值之间的关系 116

2.1.3.1 物质极性对Rf值的影响 116

2.1.3.2 Rm值及其与物质化学结构的关系 117

2.1.3.3 二肽的结构与Rf值的关系 117

2.1.4 实验条件与Rf值的关系 118

2.1.4.1 溶剂系统对Rf值的影响 118

2.1.4.2 温度对Rf值的影响 118

2.1.4.3 展层方式对Rf值的影响 119

2.1.4.4 共存物质对Rf值的影响 119

2.1.4.5 展层剂所走距离和纸的种类对Rf值的影响 119

2.2 溶剂系统 119

2.2.1 选择溶剂系统的原则 119

2.2.2 多元溶剂系统 120

2.2.3 一些有机溶剂系统的精制方法 120

2.3 滤纸 121

2.3.1 滤纸的选择 121

2.3.2 常用的层析滤纸 121

2.3.3 滤纸的净化 122

2.4 纸层析的实验技术 122

2.4.1 纸层析的展层方法及装置 122

2.4.2 滤纸的裁剪 126

2.4.3 加样方法 127

2.4.4 饱和与展层 128

2.4.5 图谱的显示 128

2.4.6 Rf值的测定 129

2.4.7 定量方法 130

2.5 特殊类型的纸层析 132

2.5.1 纸堆层析 132

2.5.2 反相层析 132

2.5.3 盐析纸层析 132

2.5.4 用被吸附剂处理过的滤纸进行层析分离 133

2.5.5 高温纸层析 133

2.6 实验举例 134

2.6.1 氨基酸单向纸层析标准曲线测定 134

2.6.2 氨基酸的双向纸层析 135

2.6.3 核苷酸的纸层析 135

2.6.4 糖的纸层析 136

2.6.5 用环形纸层析分离茶叶中的咖啡因 136

2.6.6 用反相纸层析分离高级脂肪酸 136

附录一 纸层析常用的溶剂系统 137

附录二 纸层析的重要显色剂的配制 138

第三章 离子交换柱层析 141

3.1 引言 141

3.2 离子交换树脂 142

3.2.1 离子交换树脂的分类 142

3.2.2 离子交换树脂的合成 142

3.2.3 离子交换树脂合成举例 144

3.2.3.1 阳离子交换树脂 144

3.2.3.2 阴离子交换树脂 145

3.2.4 离子交换树脂的性质 145

3.2.4.1 离子交换树脂的物理性质 145

3.2.4.2 离子交换树脂的化学性质 146

3.3 离子交换平衡和选择性 149

3.4 离子交换动力学 151

3.5 离子交换柱层析的基本原理 152

3.6 离子交换柱层析的实验技术 154

3.6.1 离子交换树脂的选择 154

3.6.2 树脂颗粒大小的选择和处理 154

3.6.2.1 树脂的筛选和浮选 154

3.6.2.2 树脂的处理 155

3.6.3 仪器设备 156

3.6.3.1 层析柱 156

3.6.3.2 恒流装置 156

3.6.3.3 分部收集装置 157

3.6.4 离子交换层析的操作步骤+ 157

3.6.4.1 柱的装填 157

3.6.4.2 加样和洗脱 158

3.6.4.3 洗脱液的分析 158

3.6.4.4 树脂的再生 159

3.7 离子交换柱层析在生物化学上的应用 159

3.7.1 氨基酸的层析分离 159

3.7.1.1 树脂 159

3.7.1.2 仪器设备 159

3.7.1.3 样品的处理 159

3.7.1.4 加样、洗脱和收集 160

3.7.1.5 定量测定 160

3.7.2 肽的分离 161

3.7.2.1 层析的样品 161

3.7.2.2 操作步骤 161

3.7.2.3 结果分析 161

3.7.3 核酸衍生物的分离 161

附录 162

第四章 离子交换纤维素层析 172

4.1 引言 172

4.2 离子交换纤维素 172

4.2.1 离子交换纤维素的分类 172

4.2.2 离子交换纤维素的性质 173

4.2.2.1 DEAE-纤维素 173

4.2.2.2 TEAE-纤维素 174

4.2.2.3 ECTEOLA-纤维素 175

4.2.2.4 CM-纤维素 175

4.2.2.5 P-纤维素 175

4.2.3 离子交换纤维素的合成 175

4.2.3.1 CM-纤维素的合成 175

4.2.3.2 DEAE-纤维素的合成 176

4.3 吸附与解吸 177

4.3.1 牢固吸附和有限吸附平衡 177

4.3.2 梯度洗脱 179

4.3.3 阶段洗脱 181

4.3.4 pH变化对吸附与解吸的影响 181

4.4 层析条件的选择 182

4.4.1 样品性质的鉴定和处理 182

4.4.2 离子交换纤维素的选择 182

4.4.3 交换剂颗粒大小的选择 183

4.4.4 缓冲溶液的选择 183

4.5 实验步骤 184

4.5.1 离子交换纤维素的处理 184

4.5.1.1 细颗粒的除去 184

4.5.1.2 离子交换纤维素的洗涤 184

4.5.1.3 离子交换纤维素pH的调节 184

4.5.2 装柱 185

4.5.2.1 重力沉降法 185

4.5.2.2 加压法 185

4.5.3 加样 186

4.5.3.1 加样量 186

4.5.3.2 样品的准备 186

4.5.3.3 加样的方法 187

4.5.4 洗脱 187

4.5.5 洗脱液的收集与分析 187

4.5.6 洗脱液的鉴定 187

4.5.7 再层析分离 187

4.5.8 浓缩 187

4.5.8.1 离子交换法 188

4.5.8.2 超滤法 188

4.5.8.3 用吸水剂处理 188

4.6 离子交换纤维素柱层析在生物化学中的应用举例 188

4.6.1 小牛胸腺组蛋白的分离 188

4.6.1.1 样品的制备 188

4.6.1.2 层析分离 188

4.6.2 肽的分离 189

4.6.3 人血清白蛋白的分离与提纯 189

4.6.3.1 试剂配制 189

4.6.3.2 样品处理 190

4.6.3.3 分离 190

第五章 凝胶层析 191

5.1 引言 191

5.2 凝胶层析的原理 191

5.2.1 凝胶层析的简单模型 191

5.2.2 分配系数Kd 192

5.2.3 Ve、Vav与分子量的关系 194

5.3 层析凝胶 195

5.3.1 层析凝胶的必备条件 195

5.3.2 葡聚糖凝胶 196

5.3.3 聚丙烯酰胺凝胶 198

5.3.4 交联丙烯基葡聚糖凝胶 198

5.3.5 琼脂糖凝胶 199

5.3.6 凝胶离子交换剂 203

5.4 凝胶层析的实验技术 203

5.4.1 凝胶型号的选择 203

5.4.2 凝胶颗粒大小的选择 204

5.4.3 洗脱剂的选择 205

5.4.4 凝胶的溶胀 205

5.4.5 凝胶柱的装填 206

5.4.6 调节流速 207

5.4.7 加样 207

5.4.8 洗脱 209

5.4.9 重新装填 209

5.5 影响凝胶层析的主要因素 209

5.5.1 样品 209

5.5.2 柱 210

5.5.3 凝胶颗粒大小 211

5.6 实验举例 212

5.7 凝胶的防霉与保存方法 213

5.7.1 防霉方法 213

5.7.2 保存方法 214

第六章 亲和层析 215

6.1 引言 215

6.2 亲和层析的基本原理 215

6.2.1 亲和层析的简单模型 215

6.2.2 生物大分子对配体的亲和力 217

6.3 配体 218

6.3.1 配体的必要条件 218

6.3.2 纯化酶所需的配体 218

6.3.3 纯化酶抵制剂所需的配体 219

6.3.4 纯化结合维生素的蛋白质的配体 219

6.3.5 纯化激素受体的配体 220

6.3.6 纯化抗原和抗体的配体 220

6.3.7 提纯小分子化合物所需要的配体 220

6.3.8 纯化核酸的配体 221

6.4 “手臂” 222

6.4.1 载体的空间位阻和“手臂”的作用 222

6.4.2 “手臂”的长度 223

6.4.3 “手臂”的性质 224

6.5 载体 225

6.5.1 载体的必要条件 225

6.5.2 琼脂糖凝胶 226

6.5.3 交联琼脂糖凝胶 227

6.5.4 聚丙烯酰胺凝胶 228

6.5.5 聚丙烯酰胺--琼脂糖凝胶(AcA) 228

6.5.6 葡聚糖凝胶 229

6.5.7 纤维素 229

6.5.8 多孔玻璃 230

6.6 配体和载体的偶联 231

6.6.1 配体与多糖载体的偶联 231

6.6.1.1 溴化氰活化法 231

6.6.1.2 三嗉活化法 232

6.6.1.3 高碘酸盐氧化法 232

6.6.1.4 环氧乙烷法 233

6.6.1.5 配体与多糖载体的其他偶联方法 234

6.6.2 配体与聚丙烯酰胺凝胶载体的偶联 234

6.6.2.1 聚丙烯酰胺凝胶直接活化法 234

6.6.2.2 共聚法 235

6.6.3 配体与多孔玻璃载体的偶联 235

6.6.4 蛋白质配体与载体偶联的问题 236

6.7 接“手臂” 236

6.8 亲和层析技术 238

6.8.1 亲和层析的操作方式和步骤 238

6.8.2 非专一性洗脱 239

6.8.3 专一性洗脱 241

6.8.4 亲和吸附剂的再生方法 242

6.8.5 影响亲和层析的因素 242

6.8.5.1 样品体积和流速的影响 242

6.8.5.2 温度对亲和层析的影响 243

6.9 实验举例 243

6.9.1 尿激酶的纯化 243

6.9.2 a-胰凝乳蛋白酶的提纯 243

第七章 气相层析 245

7.1 概况 245

7.1.1 气相层析的进展 245

7.1.2 气相层析的分类 245

7.1.3 气相层析仪流程 246

7.1.4 气相层析的特点 246

7.2 基本概念和基本理论 247

7.2.1 层析图 247

7.2.2 基线 247

7.2.3 峰高 247

7.2.4 峰面积 247

7.2.5 峰宽与半峰宽 247

7.2.6 死时间t0和死体积V0 247

7.2.7 保留时间tR和保留体积VR 248

7.2.8 实际保留时间t R 248

7.2.9 校正保留时间t？和校正保留体积V？ 248

7.2.10 保留温度TR(K) 248

7.2.11 比保留体积Vg 248

7.2.12 相对保留值 248

7.3 气相层析仪 249

7.3.1 气路系统 249

7.3.2 进样系统 250

7.3.3 温度控制系统 251

7.3.4 层析柱 252

7.4 检测器 252

7.4.1 检测器的应答值 252

7.4.1.1 检测器应答值的定义 252

7.4.1.2 检测器应答值的测定 253

7.4.1.3 相对应答值 254

7.4.2 检测器的敏感度 254

7.4.3 热导池检测器 254

7.4.4 氢焰离子化检测器(氢焰检测器) 255

7.4.4.1 氢焰检测器的工作原理 255

7.4.4.2 氢焰检测器离子室的结构 256

7.4.4.3 氢焰检测器的操作条件 256

7.4.5 电子捕获检测器 257

7.4.5.1 电子捕获检测器的结构和工作原理 257

7.4.5.2 工作条件的选择 257

7.5 固定相 258

7.5.1 固体固定相 258

7.5.2 固定液 262

7.5.2.1 固定液必须具备的条件 262

7.5.2.2 影响组分在固定液中溶解度的因素 262

7.5.2.3 固定液的选择 263

7.5.2.4 固定液的涂渍和老化 264

7.5.3 层析柱的填充方法 264

7.5.3.1 填充性的装填方法 264

7.5.3.2 毛细管柱的涂渍方法 265

7.6 担体 265

7.6.1 担体的分类 265

7.6.2 硅藻土型担体 266

7.6.2.1 红色担体 266

7.6.2.2 白色担体 266

7.6.2.3 硅藻土型担体的处理方法 266

7.6.3 非硅藻土型担体 268

7.6.3.1 玻璃微球 268

7.6.3.2 氟担体 268

7.6.4 担体的选择 269

7.7 定量分析 269

7.7.1 峰面积的测量方法 270

7.7.1.1 几何图解法 270

7.7.1.2 峰高乘保留时间法 270

7.7.1.3 自动积分仪法 270

7.7.1.4 求积仪法 271

7.7.1.5 剪纸称重法 271

7.7.1.6 未完全分离峰面积的测量 271

7.7.2 定量方法 271

7.7.2.1 归一化法 271

7.7.2.2 外标法 272

7.7.2.3 内标法 272

7.7.2.4 内加法 273

7.8 气相层析在氨基酸分析上的应用 274

7.8.1 氨基酸用三氟乙酸酐(TFAA)酰化 274

7.8.2 氨基酸的PTH化 275

第三篇 区带电泳法 277

第一章 绪论 277

1.1 电泳法发展简史 277

1.2 何谓区带电泳 279

1.3 理论概要 281

1.3.1 迁移率 281

1.3.2 pH变化对带电物质离子化的响影 283

1.3.3 胶体颗粒的电动电位 286

1.3.4 电渗与电渗的校正 289

1.3.5 带电质点在支持介质上的迁移率 291

第二章 纸电泳 294

2.1 纸电泳的一般方法 294

2.1.1 直流电源 294

2.1.2 电极 294

2.1.3 分析的样品 295

2.1.4 支持滤纸的方法 295

2.1.4.1 平卧法 295

2.1.4.2 悬挂法 295

2.1.5 滤纸的选择 297

2.1.6 缓冲液溶的选择 297

2.1.7 点样 298

2.1.8 电泳条件 299

2.1.9 分离样品的定位--定性检定 299

2.1.10 定量测定 301

2.2 双向纸电泳 301

2.2.1 两向均为电泳 301

2.2.2 一向电泳，一向层析 301

2.2.2.1 先电泳后层析或先层析后电泳 302

2.2.2.2 同时进行电泳和层析 302

2.3 连续纸电泳 302

2.4 高压纸电泳 303

2.4.1 一般介绍 303

2.4.2 生物液体中氨基酸的分离 305

2.4.3 肽段的分离 306

2.4.3.1 制备混合肽 306

2.4.3.2 电泳和层析两向分离 307

2.4.3.3 作指纹图谱 308

第三章 薄层电泳 311

3.1 引言 311

3.2 一般方法要点 311

3.2.1 电泳 置 311

3.2.2 薄层材料 312

3.2.3 缓冲溶液 312

3.2.4 薄层板的制备 312

3.2.5 加样及电泳 313

3.2.6 薄层板的冷冻干燥处总 313

3.3 层析电泳双向分离法 313

3.3.1 制作肽图的一般过程 313

3.3.2 制作肽图的步骤 314

3.3.2.1 蛋白质的水解 314

3.3.2.2 先层析后电泳双向分离制成肽图 314

3.4 凝胶过滤-电泳双向薄层方法 314

3.4.1 Sephadex薄层板的制备 315

3.4.2 凝胶过滤 315

3.4.3 电泳 316

3.4.4 检出分离的蛋白质分部 316

3.5 应用举例 316

3.5.1 检测用荧光胺标记的伯胺类物质 316

3.5.1.1 荧光团的制备 316

3.5.1.2 薄层层析 316

3.5.1.3 电泳 317

3.5.2 用荧光胺作为喷洒试剂在肽图上检测分离的肽 317

3.5.3 氨基酸的双向分离 317

第四章 醋酸纤维膜电泳 319

4.1 醋酸纤维膜电泳的特点 319

4.2 电泳装置 319

4.2.1 通用型电泳槽 319

4.2.2 小型电泳槽 320

4.3 缓冲溶液 320

4.4 电泳分离前膜的准备 321

4.5 加样 321

4.6 电泳 322

4.7 分离区带的检测 323

4.7.1 染色 323

4.7.1.1 一般蛋白质染色 323

4.7.1.2 糖蛋白染色 324

4.7.1.3 脂蛋白染色 324

4.7.2 洗涤脱色 324

4.7.3 染色膜的干燥和透明 324

4.7.4 膜的检定 325

4.8 应用举例 325

4.8.1 血红蛋白的分离 325

4.8.1.1 血红蛋白溶液的制备 325

4.8.1.2 加样 326

4.8.1.3 电泳 326

4.8.1.4 检定 326

4.8.2 血清中结合珠蛋白的测定 326

4.8.2.1 原理 326

4.8.2.2 电泳 327

4.8.2.3 检定 327

4.8.3 同工酶的分离检定 327

4.8.3.1 所需试剂 327

4.8.3.2 操作步骤中的注意点 327

4.8.4 核苷酸的分离 328

4.8.5 氨基酸分析 328

4.9 实验结果不满意或实验失败的可能原因 329

4.9.1 醋酸纤维膜 329

4.9.2 缓冲溶液 329

4.9.3 样品和加样 329

4.9.4 电泳 329

4.9.5 染色和透明 330

第五章 凝胶免疫电泳 331

5.1 引言 331

5.2 琼脂凝胶免疫电泳方法 333

5.2.1 琼脂凝胶的制备 333

5.2.2 电泳 333

5.2.3 免疫沉淀 333

5.3 高压琼脂免疫电泳 333

5.4 定量免疫电泳 334

5.4.1 定量免疫电泳的依据和要求 334

5.4.2 定量免疫电泳所需的试剂 335

5.4.2.1 电泳支持介质--琼脂糖 335

5.4.2.2 缓冲溶液 335

5.4.2.3 染色溶液和脱色溶液 335

5.4.2.4 抗体(抗血清) 335

5.4.3 火箭免疫电泳 336

5.4.3.1 电泳板的制备 336

5.4.3.2 电泳 337

5.4.3.3 检定 337

5.4.4 双向免疫电泳 338

5.4.4.1 手工双向免疫电泳法 338

5.4.4.2 半自动双向免疫电泳法 338

5.4.4.3 双向免疫电泳图谱的检定 339

5.4.4.4 双向免疫电泳的应用 340

5.4.5 定量免疫电泳存在的问题 340

5.4.6 免疫电泳方法中应注意的一些问题 341

5.5 其他形式的免疫电泳简介 343

5.5.1 交叉免疫电泳 343

5.5.2 薄层凝胶过滤免疫电泳 345

5.5.3 放射对流免疫电泳 346

5.5.4 线形免疫电泳 347

第六章 聚丙烯酰胺凝胶电泳 351

6.1 引言 351

6.2 聚丙烯酰胺凝胶 352

6.2.1 凝胶的结构及用量计算 352

6.2.2 凝胶的催化聚合过程 354

6.2.3 凝胶的分子筛效应 355

6.2.4 凝胶的浓度，交联度和不同颗粒电泳迁移率之间的关系 355

6.3 不连续 盘电泳原理概要 356

6.4 缓冲溶液的选择原则 358

6.5 分析圆盘电泳方法 360

6.5.1 必要的设备 360

6.5.2 凝胶组成成分的化学、物理性质 360

6.5.3 丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺浓度的测定方法 362

6.5.4 单体的纯度问题和纯化方法 362

6.5.5 凝胶系统及其组成 363

6.5.6 圆柱形凝胶的制备 363

6.5.6.1 分离胶的制备 363

6.5.6.2 堆集胶的制备 367

6.5.6.3 样品胶的制备 367

6.5.6.4 影响凝胶聚合的因素 367

6.5.7 电泳 368

6.5.7.1 安装电泳管 368

6.5.7.2 加样 368

6.5.7.3 加电极缓冲液 368

6.5.7.4 加指示染料 369

6.5.7.5 电泳 369

6.5.8 凝胶的取出 370

6.5.9 凝胶的固定和染色--分离区带的检定 370

6.5.9.1 蛋白质的一般染色方法 370

6.5.9.2 含金属蛋白质的染色 371

6.5.9.3 脂蛋白的染色 371

6.5.9.4 糖蛋白的染色 371

6.5.9.5 核酸的染色 371

6.5.10 脱色 371

6.5.11 定量分析 372

6.5.11.1 切片抽提法 372

6.5.11.2 微量光密度计法 372

6.5.11.3 计数法 373

6.5.11.4 放射自显影法 373

6.6 蛋白质分子量的测量 373

6.6.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量的根据和要求 373

6.6.2 求商法测定分子量 374

6.7 分析RNA时应注意的一些问题 375

6.7.1 制胶 375

6.7.2 RNA样品问题 375

6.7.3 缓冲溶液的离子强度 376

6.7.4 电泳时的温度 376

6.7.5 其他的注意事项 376

6.8 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 376

6.8.1 概况 376

6.8.2 测定分子量的SDS凝胶电泳方法 378

6.8.2.1 试剂的配制 378

6.8.2.2 凝胶的制备 378

6.8.2.3 样品液的制备 380

6.8.2.4 电泳步骤 380

6.8.2.5 检定 382

6.8.3 凝胶的保存方法 383

6.8.3.1 湿法保存凝胶 383

6.8.3.2 干法保存凝胶 383

6.8.4 影响蛋白质电泳迁移率造成分子量测定误差的因素 383

6.8.4.1 SDS的结合程度 384

6.8.4.2 样品本身的荷电性质 384

6.8.4.3 蛋白质分子量和分子大小 384

6.8.4.4 其他影响因素 384

6.8.5 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量的局限性 384

6.9 双向聚丙烯酰胺凝胶电泳 385

第七章 制备电泳 387

7.1 引言 387

7.2 制备性圆盘电泳装置A型 387

7.2.1 电极缓冲液室 388

7.2.2 电泳柱 388

7.2.3 环形洗脱室 388

7.2.4 法兰锤体 388

7.2.5 夹环 388

7.2.6 电泳步骤 389

7.2.6.1 凝胶溶液、电极缓冲液和冲洗缓冲液的配制 389

7.2.6.2 电泳装置各部件的组装和电泳 389

7.2.7 几点讨论 390

7.3 制备性圆盘电泳装置B型 391

7.3.1 电泳装置的几个主要部件 391

7.3.1.1 凝胶支持管 391

7.3.1.2 绝热套 392

7.3.1.3 透析滤膜和膜的固定环 392

7.3.1.4 缓冲液槽 392

7.3.1.5 电极 392

7.3.2 具体操作 392

7.3.2.1 选择缓冲液 392

7.3.2.2 凝胶柱的制备 393

7.3.2.3 电泳体系的性能试验 393

7.3.2.4 加样 394

7.3.3 应注意的几个问题 394

7.4 若干种蛋白质的分离制备条件 395

7.5 Pevikon制备板电泳 396

7.5.1 电泳装置 396

7.5.2 电泳步骤 396

7.5.2.1 支持介质Pevikon的处理 396

7.5.2.2 制Pevikon电泳板 396

7.5.2.3 加样 397

7.5.2.4 分离区带的分段回收 397

7.5.3 高压制备板电泳 397

7.5.3.1 高压制备板电泳装置 398

7.5.3.2 电泳前应注意的几个问题 398

7.5.4 应用举例 399

7.5.4.1 糖肽和糖蛋白的分离 399

7.5.4.2 蛋白类的分离 399

7.5.4.3 尿中肽类的分离 399

7.5.4.4 血清中球蛋白的分离 399

第八章 等电聚焦 401

8.1 等电聚焦的基本原理 401

8.2 pH梯度的组成 401

8.3 人工合成的载体两性电解质 402

8.4 稳定介质 403

8.5 密度梯度柱等电聚焦 403

8.5.1 U型管等电聚焦方法 403

8.5.2 Vesterberg和Svensson的等电聚焦方法 404

8.5.3 Grant和Leaback的等电聚焦方法 407

8.5.3.1 Isco密度梯度电泳柱的特点 407

8.5.3.2 进行等电聚焦所需的必要部件以及所用的几种溶液 407

8.5.3.3 不在中心管内进行分析的等电聚焦操作步骤 409

8.5.3.4 在中心管内进行分析的等电聚焦操作步骤 410

8.5.4 对密度梯度等电聚焦方法的几点讨论 410

8.5.4.1 二性载体的选择 410

8.5.4.2 样品 411

8.5.4.3 对聚焦带的检测 412

8.5.4.4 二性载体的去除 412

8.6 凝胶介质中的等电聚焦 412

8.6.1 凝胶等电聚焦的特点 412

8.6.2 柱状凝胶等电聚焦 413

8.6.2.1 装置 413

8.6.2.2 凝胶的制备 413

8.6.2.3 加样 414

8.6.2.4 等电聚焦操作步骤 414

8.6.3 薄层凝胶等电聚焦 416

8.6.3.1 装置 416

8.6.3.2 薄层凝胶的制备 417

8.6.3.3 加样 419

8.6.3.4 等电聚焦步骤中需要注意的问题 419

8.7 对方法的几点讨论 420

第四篇 放射免疫法 422

第一章 放射免疫测定的基本知识 422

1.1 引言 422

1.2 术语 422

1.3 放射免疫测定的早期发展史 423

1.4 结合测定的基本原理 424

1.5 结合体稀释曲线和标准曲线 426

1.6 标准曲线的不同制作方法 429

1.7 K值的重要性 431

1.8 K值的测定 431

1.9 放射免疫测定的缓冲液和常用添加剂 432

第二章 放射免疫测定需要一个纯化的抗原 434

2.1 结合测定的要求 434

2.2 需要一个纯化的抗原(配体) 434

2.3 纯配体的优越性 435

2.3.1 大分子蛋白激素 436

2.3.2 癌胚抗原 436

2.3.3 类固醇激素和药物 436

2.3.4 小肽激素 437

2.4 纯化的配体与内源性配体的不一致性 437

2.5 标准品 438

2.6 材料的贮藏 440

第三章 放射免疫测定需求一个标记的抗原 442

3.1 放射性同位素 442

3.2 放射性同位素的计数 443

3.3 计数仪的选择 444

3.4 同位素计数方面的某些问题 445

3.5 标记物的基本特性 446

3.6 标记物的制备 446

3.7 碘化标记物 447

3.7.1 碘化法 447

3.7.2 碘化作用的损伤 449

3.7.3 碘化标记物的纯化 451

3.7.4 标记物的化学分析 452

第四章 放射免疫测定对抗体的要求 455

4.1 抗体的化学性质 455

4.2 抗原的化学性质 456

4.3 免疫应答的细胞学基础 456

4.4 免疫反应的生理学 457

4.5 放射免疫测定所需抗体的性质 457

4.6 抗体的产生 458

4.7 免疫原的性质和剂量 459

4.8 作为免疫原的半抗原的制备 459

4.9 佐剂 461

4.10 动物的品种 461

4.11 免疫的途径 461

4.12 注射时间和采抗血清的时间 462

4.13 对于放射免疫抗血清的选择 463

4.14 抗体的贮存 464

第五章 放射免疫测定时游离相与结合相的分离 465

5.1 分离方法的有效性 465

5.2 分离方法的实用性 466

5.3 分离游离相和结合相的方法 467

5.3.1 电泳 467

5.3.2 凝胶过滤 467

5.3.3 吸附方法 468

5.3.3.1 活性炭吸附 468

5.3.3.2 硅胶和硅藻土的吸附 468

5.3.3.3 羟基磷灰石 469

5.3.4 分部沉淀 469

5.3.5 双抗体法 470

5.3.5.1 “双抗体”或“第二”抗体 470

5.3.5.2 固相化的第二抗体 471

5.3.6 固相体系 472

5.3.6.1 结合体附着到圆盘和试管壁表面 472

5.3.6.2 结合体连接到特殊的固相上 472

5.3.7 结论：分离步骤的选择 473

第六章 放射免疫测定的灵敏度 474

6.1 灵敏度(sensitivity)的定义 474

6.2 增加放射免疫测定灵敏度的方法 475

6.2.1 减少标记物的用量 475

6.2.2 减少结合体的用量 476

6.2.3 增加保温时间 476

6.2.4 减少保温时间--非平衡分析法 477

6.2.5 试剂加入的顺序 477

6.2.6 采用亲和力高的抗体 478

6.2.7 增加样品的体积 478

6.2.8 提高保温的温度 478

6.2.9 增加样品重复测定的次数 479

6.2.10 抽提和浓缩配体 479

6.3 降低放射免疫测定灵敏度的方法 479

6.4 放射免疫测定的靶区--范围的重要性 480

6.5 结论 481

第七章 放射免疫测定的特异性 482

7.1 特异性(specificity)的定义 482

7.2 专一的非特异性(specific non-specificity) 482

7.2.1 专一的非特异性的基础 482

7.2.2 专一的非特异性的估计 483

7.2.3 改进特异性的方法 485

7.3 非专一的非特异性(non-specific non-specificity) 486

7.3.1 样品中存在干扰抗原-抗体反应的物质 487

7.3.2 样品中空白值的变化 487

7.3.3 抗体或标记物的破坏或掩蔽 487

7.3.4 未标记配体的破坏或掩蔽 488

7.3.5 非专一的非特异性作用的判别和去除 488

第八章 放射免疫测定的精确性 490

8.1 精确性(precision)的定义 490

8.2 影响精确性的因素 490

8.2.1 试剂和分析设计中的问题 490

8.2.2 分析过程中操作的差错 493

8.3 监测结合分析精确性的方法 494

8.3.1 对于监测精确性的质量控制物质的制备 494

8.3.2 用质量控制物质来检查精确性的方法 495

8.3.3 监测精确性的其他方法 497

8.4 结合测定最适精确性方法的建立 498

8.5 在放射免疫测定中对精确性评价方面国内的一些建议 498

第九章 放射免疫测定与其他分析类型的关系 500

9.1 对测定方法的要求 500

9.2 受体分析(Receptor Assay) 500

9.3 血液结合蛋白分析(circulating binding protein assays) 501

9.4 免疫分析(immunoassays) 501

9.5 结论 503

第十章 放射免疫测定操作的安全预防措施 504

10.1 放射免疫实验室中的放射性危险 504

10.2 管理总则 504

10.3 标记规则 505

10.4 实验室监测 505

10.5 放射性废物处理 505

10.6 放射免疫实验室的设计 506