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关键词 1

第一章 组织培养技术及细胞生物学检测 1

第一节组织培养的基本技术 1

一、培养用品的清洗和消毒灭菌 1

二、无菌操作 4

三、培养用液 5

四、组织细胞的分离与培养 8

五、传代培养 10

六、一些特殊培养法 10

第二节特殊细胞和组织的培养 11

一、上皮细胞原代培养 11

二、中胚层细胞的培养 15

三、神经组织细胞培养 16

四、巨噬细胞的培养 16

第三节细胞克隆化培养 17

一、有限稀释法 17

二、平皿克隆分离法 18

三、单细胞显微操作法 18

第四节细胞培养污染的检测和排除 19

一、污染途径 19

二、污染对细胞的影响 20

三、微生物污染的检测和防治 20

第五节细胞生物学和遗传学检测 21

一、相差显微镜观察 21

二、细胞计数 22

三、接种存活率测定 23

四、细胞生长曲线和倍增时间测定 24

五、细胞分裂指数测定 25

六、细胞周期参数的测定 26

七、克隆形成率测定 27

八、裸鼠接种致瘤实验 28

九、染色体核型分析 29

第二章 分子生物学实验基本技术 31

第一节质粒和噬菌体DNA的制备 31

一、质粒DNA的小量制备 31

二、质粒DNA的大量制备 33

三、质粒DNA的纯化和保存 34

四、噬菌体DNA的制备 37

第二节原核细胞核酸的制备 39

一、原核细胞基因组DNA的制备 39

二、原核细胞基因组RNA的制备 41

第三节真核细胞基因组核酸的制备 43

一、真核细胞基因组DNA的制备 43

二、真核细胞总RNA的制备 48

第四节核酸的纯化及定量 51

一、核酸的纯化 51

二、核酸的定量 53

第五节凝胶电泳 54

一、琼脂糖凝胶电泳 55

二、聚丙烯酰胺凝胶电泳 59

三、脉冲场凝胶电泳 61

第六节核酸的酶学操作 62

一、限制性内切酶的酶学分析 62

二、其他常用酶类 66

第三章 核酸分析技术 70

第一节核酸分子探针的标记 70

一、核酸分子探针的来源 70

二、核酸分子探针的标记 71

第二节核酸杂交技术 78

一、滤膜印迹杂交 79

二、液相杂交技术 91

三、核酸原位杂交 95

第三节DNA序列测定 101

一、测序策略 102

二、末端终止法 104

三、Maxam-Gilbert DNA化学降解法 118

第四节基因突变分析技术 121

一、限制性片段长度多态性 122

二、以聚合酶链反应为基础的突变检测技术 123

三、单核苷酸多态性 127

四、其它方法 128

第四章 聚合酶链式反应 130

第一节原理 130

一、DNA模板的变性 130

二、模板与引物的结合 130

三、引物延伸 131

第二节PCR反应的成分和作用 131

一、耐热DNA聚合酶 131

二、缓冲液 133

三、dNTP 133

四、模板核酸 133

五、引物 134

第三节引物设计一般性原则 134

一、引物长度 134

二、G+C含量 134

三、碱基分布的随机性 134

四、引物自身 135

五、引物之间 135

六、引物的3′端 135

七、引物的5′端 135

八、引物的特异性 135

第四节PCR相关技术 135

一、通用PCR 135

二、RT-PCR 137

三、多重PCR 137

四、套式PCR 137

五、PCR结合特异寡核苷酸探针斑点杂交法 138

六、PCR－限制性片断长度多态性分析 138

七、任意引物PCR 138

八、PCR－单链构象多态性分析 139

九、原位PCR 139

第五节PCR产物纯化、回收、定量、克隆及测序 140

一、PCR产物纯化、回收 140

二、PCR产物的定量 141

三、PCR产物的克隆 141

四、PCR产物的测序 142

第五章 基因克隆 143

第一节基因克隆策略 143

一、全基因组扫描基因定位策略 143

二、定位－候选克隆和计算机克隆策略 145

三、基因表达差异克隆策略 146

第二节cDNA文库的构建及筛选 147

一、cDNA文库的构建 147

二、cDNA文库筛选 149

第三节差异表达的基因克隆方法 151

一、mRNA差异显示法 151

二、抑制性消减杂交 155

第四节cDNA全长克隆方法 158

一、cDNA末端快速扩增技术 158

二、染色体步移法 167

三、EST介导的基因克隆 171

第六章 DNA重组技术 172

第一节DNA重组技术的定义及步骤 172

一、目的基因的制备 172

二、载体的构建 173

第二节细菌感受态的制备和质粒的转化 177

一、菌株的培养、保存和复苏 177

二、感受态细胞的制备 177

三、细菌的转化 178

第三节DNA重组反应 179

一、粘端连接 179

二、平端连接 180

三、定向连接 181

第四节含重组质粒的细菌菌落的鉴定 181

一、a互补 181

二、插入失活 182

三、菌落原位杂交 183

四、限制酶酶切分析 184

五、DNA序列测定 184

第七章 基因转染技术 185

第一节物理化学法 185

一、磷酸钙沉淀法 185

二、DEAE－葡聚糖介导法 188

三、电穿孔法 189

四、脂质体介导法 191

第二节病毒载体法 193

一、逆病毒载体法 193

二、腺病毒载体法 200

第三节转染细胞的筛选与分离 203

一、哺乳动物细胞常用的遗传选择标记 204

二、利用G418筛选和分离转染的细胞 206

第八章 真核基因表达分析 208

第一节体内表达系统 208

一、主要设备 209

二、主要试剂 209

三、获得胚胎 209

四、去除胶状外膜和卵黄膜 211

五、显微注射 211

六、动物帽切割和培养 212

第二节体外表达系统 212

一、四环素基因表达系统 213

二、荧虫酶 216

三、绿色荧光蛋白 217

第三节真核基因表达调控研究方法 220

一、DNase-Ⅰ超敏感性分析 221

二、DNA甲基化分析 223

三、引物延伸法确定转录的起始位点 224

四、体外转录 224

五、进行中的核转录分析 225

六、氯霉素乙酰基转移酶分析 225

七、凝胶滞留分析 227

八、Southwestern印迹 227

九、DNA足迹分析 228

十、DNA结合蛋白的分离纯化 229

十一、酵母双杂交 230

第九章 基因表达蛋白质的检测与分析 231

第一节蛋白质的体外表达 231

一、蛋白质在大肠杆菌中的表达 231

二、蛋白质在真核细胞中的表达 234

第二节表达蛋白的纯化 237

一、细菌裂解 238

二、包涵体的洗涤与纯化 239

三、包涵体的溶解 240

四、蛋白质的复性 241

五、融合蛋白的定点裂解 241

六、融合蛋白的纯化 244

第三节抗体制备和纯化 246

一、多克隆抗体制备 246

二、单克隆抗体制备 248

三、盐析法纯化免疫球蛋白 250

四、DEAE-Sephadex A-50柱层析纯化免疫球蛋白 252

五、Sepharose CL-4B亲和柱层析纯化IgG及IgG亚类 254

六、高效液相色谱纯化小鼠腹水中单克隆抗体 255

第四节免疫学检测 256

一、免疫酶技术 256

二、免疫组织化学 258

三、放射免疫技术 262

四、免疫斑点试验 264

五、免疫沉淀法 265

六、Western印迹法 267

第五节蛋白质组学技术 270

一、蛋白质组学简介 270

二、蛋白质组学研究常用的技术方法 272

三、蛋白质组学研究技术目前存在的问题 275

第十章 基因工程抗体 277

第一节嵌合抗体 277

一、构建嵌合抗体的基本原理 277

二、方法 278

第二节改形抗体 279

一、构建改形抗体的一般性原则 279

二、改形抗体可变区基因的构建与表达 280

第三节抗体库技术 283

一、基本原理 283

二、方法 284

第四节基因工程抗体的纯化和鉴定 299

一、抗体的纯化 299

二、抗体活性的测定 300

三、抗体亲和力的测定 300

四、抗体可变区基因序列测定及分析 301

第十一章 DNA芯片技术 303

第一节DNA芯片的制作原理 303

一、载体材料的选择 304

二、DNA方阵的构建方法 304

三、样品制备、杂交和检测 304

第二节微阵列的选择 306

第三节芯片技术在医学领域的应用 307

一、测序 307

二、基因表达水平的检测 307

三、基因诊断 308

四、基因芯片在肿瘤研究中的潜在用途 308

五、药物筛选 309

六、给药个性化 309

七、检测基因突变和多态性 310

第四节芯片技术存在的问题和前景 311

一、存在问题 311

二、进展 312

第十二章 基因工程小鼠 317

第一节胚胎干细胞 317

一、实验材料 318

二、ES细胞的培养 319

第二节转基因小鼠 328

一、微注射DNA的制备与纯化 329

二、转基因鼠的构建方法 330

三、转基因鼠系的建立 335

第三节基因敲除／敲入小鼠 335

一、基因打靶载体的构建 336

二、将打靶载体转入受体细胞中 346

三、用选择性培养基筛选已击中细胞 346

四、基因打靶细胞鉴定工作 347

五、产生嵌合体动物和基因打靶动物 347

第四节核移植技术 348

一、供体细胞准备 350

二、受体细胞的准备和移核 351

三、去核卵母细胞与供体细胞融合 351

四、移核后卵母细胞的激活 353

五、核移植重构胚的体外培养 353

六、克隆胚胎的移植 354

第十三章 生物信息学 356

第一节概论 356

一、生物信息数据库 357

二、生物信息学软件 363

三、生物信息学资源 365

第二节基因组生物信息学 366

一、序列比对与数据库搜索 368

二、基因识别 377

三、序列翻译与ORF预测 379

四、蛋白质基序和结构域识别 380

五、蛋白3D同源模型构建 382

六、限制性酶切图谱 383

七、引物设计 383

第三节蛋白质组信息学 386

一、蛋白质组信息学 386

二、蛋白质组信息学相关资源 390

附录一分子生物实验室的常规仪器及设施 392

附录二放射性核素的基本知识 404

附录三细胞培养室 411

附录四常用试剂的配制 416

附录五常用单位换算 425

附录六在线生物软件介绍 427

附录七英汉医学分子生物学常用缩略语 432

附录八主要参考文献 456