基因克隆技术在制药中的应用PDF电子书下载

第一章 基因克隆技术概述 1

第一节 基因克隆技术 1

一、基因克隆技术的诞生和兴起 1

上篇 技术篇 1

二、基因克隆技术的特点与步骤 3

第二节 基因克隆技术早期开创性研究成就 5

第二章 基因克隆技术制药中常用的工具酶 8

第一节 限制性核酸内切酶 8

一、限制酶的发现 8

二、限制酶的类型 9

三、限制酶的命名 10

四、Ⅱ型限制酶的特性 10

五、DNA的单酶切与限制片段末端连接 13

二、基因工程中常用的连接酶 14

第二节 DNA连接酶 14

一、DNA连接酶连接作用的特点 14

三、DNA连接酶连接作用的分子机理 15

第三节 DNA聚合酶 16

一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 16

二、Klenow大片段酶 18

三、T4噬菌体DNA聚合酶 19

四、经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶 19

五、TaqDNA聚合酶及AmpliTaqTMDNA聚合酶 20

六、反转录酶 20

第四节 DNA修饰酶 21

一、末端脱氧核苷酸转移酶 21

二、碱性磷酸酶 21

一、S1核酸酶 22

三、T4噬菌体多核苷酸激酶 22

第五节 单链核酸内切酶 22

二、Bal31核酸酶 23

第六节 核酸外切酶 24

一、核酸外切酶Ⅶ 24

二、核酸外切酶Ⅲ 24

三、λ核酸外切酶 25

第三章 基因克隆技术制药常用质粒载体 26

第一节 质粒概述 26

第二节 质粒DNA分子的基本特性 28

一、质粒的构型、特性与大小 28

二、质粒DNA的复制 29

三、质粒DNA的提取与纯化 31

四、质粒DNA浓度和纯度的测定 32

一、理想质粒需满足的条件 33

第三节 主要质粒载体的改造和构建 33

二、质粒载体发展阶段 34

三、pBR322质粒载体 35

四、pUC质粒载体 38

五、其他重要的质粒载体 41

第四章 基因克隆技术制药常用噬菌体载体 43

第一节 λ噬菌体载体 43

一、λ噬菌体的基本特性 43

二、λ噬菌体基因组的结构与功能 45

三、λ噬菌体载体的改造与构建 46

四、常用的λ噬菌体载体 49

五、改良型λ噬菌体载体 52

一、黏粒载体的构建 54

第二节 黏粒载体 54

三、常用的黏粒载体 55

二、黏粒载体的特点 55

第三节 M13噬菌体载体 57

一、M13噬菌体的基本特性 57

二、M13噬菌体载体的构建 58

三、M13噬菌体载体系列的优点 61

第四节 噬菌粒载体 61

一、pUC118和pUC119噬菌粒载体 61

二、pBluescript噬菌粒载体 62

第五节 哺乳动物细胞载体系统 64

第五章 基因工程药物目的基因制取 65

第一节 目的基因的化学合成 65

一、构建基因文库法分离目的基因的基本步骤 68

第二节 构建基因文库法分离目的基因 68

二、真核基因组DNA文库的构建过程 71

第三节 酶促合成法制取目的基因 73

一、真核生物细胞中的mRNA 73

二、从构建的cDNA文库中筛选目的cDNA 74

三、RT-PCR法合成目的cDNA 79

第六章 目的基因与克隆载体的体外重组 83

第一节 目的基因与质粒载体的连接 83

一、黏性末端连接法 83

二、定向克隆法 85

三、平末端连接法 87

四、同聚物加尾法 88

五、加人工接头连接法 90

七、其他转换末端形式连接法 91

六、加DNA衔接物连接法 91

第二节 目的基因与λ噬菌体载体的连接 93

一、λ噬菌体载体臂DNA的制备 93

二、λ噬菌体载体臂与目的DNA片段的连接 94

第七章 重组克隆载体引入受体细胞 95

第一节 受体细胞概述 95

一、基因克隆的受体细胞 95

二、重组体分子导入受体细胞的途径 96

第二节 重组体DNA分子的转化或转染 97

一、用氯化钙制备新鲜的感受态细胞转化法 97

二、用复合剂制备感受态细胞转化法 98

三、高压电穿孔转化法 99

第三节 重组λ噬菌体DNA的体外包装与转导 99

二、λ噬菌体DNA的体外包装 100

一、λ噬菌体体外包装的基本原理 100

三、包装提取物的制备 101

四、重组λDNA的体外包装与感染方法 101

第四节 重组克隆载体导入哺乳动物细胞的转染 102

第八章 目的重组克隆的筛选、鉴定与分析 104

第一节 含目的基因重组克隆的筛选 104

一、抗生素抗性基因插入失活法 104

二、β-半乳糖苷酶基因插入失活法 105

三、快速细胞破碎与凝胶电泳筛选法 105

四、放射性标记核酸探针杂交筛选法 106

五、免疫化学筛选法 112

第二节 目的重组克隆的鉴定 114

一、酶切及凝胶电泳鉴定法 114

二、Southern印迹杂交法 116

四、电镜R-环检测法 117

三、Northern印迹法 117

五、免疫学检测法 118

六、基因产物鉴定法 121

第三节 重组DNA的序列分析 121

一、Sanger双脱氧链终止法DNA测序 122

二、Maxam-Gilbert化学修饰法DNA测序 125

三、快速自动化DNA测序 126

第九章 目的基因在宿主细胞中的表达 127

第一节 外源目的基因在原核细胞中的表达 127

一、原核基因表达载体的构成 127

二、常见的原核细胞表达载体系统 131

三、外源目的基因在原核细胞中的表达形式 132

四、在原核细胞中高效表达目的基因 134

五、基因定点诱变技术 136

第二节 外源目的基因在真核细胞中的表达 139

一、真核细胞表达载体的功能元件 139

二、酵母菌表达系统 141

三、昆虫细胞表达系统 145

四、哺乳动物细胞表达系统 146

下篇 应用篇 151

第十章 基因克隆技术制药概述 151

第一节 基因克隆技术的应用与发展趋势 152

一、全球性的基因工程争夺战 152

二、蛋白质工程的研究开发飞速发展 153

三、转基因动植物生产药物的研究迅速崛起 154

五、基因治疗技术取得重大进展 155

六、国际“人类基因组计划”提前完成 155

四、医学科学研究取得巨大成就 155

第二节 基因克隆技术与生物制药 157

一、基因克隆技术制药发展态势 157

二、主要基因工程药物简介 158

第十一章 生物药物基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 163

第一节 人白细胞介素基因的克隆与表达 163

一、人白细胞介素-2融合蛋白工程菌的组建 163

二、人白细胞介素-11的克隆及其融合蛋白表达 164

第二节 集落刺激因子基因的克隆与表达 167

一、GM-CSF重组表达载体与工程菌的组建 167

二、GM-CSF/IL-3融合蛋白基因的克隆与表达 167

第三节 纤溶酶原激活剂基因的克隆与表达 170

第四节 碱性成纤维细胞生长因子基因的克隆与表达 171

一、hIGF-Ⅰ在大肠杆菌蛋白酶缺陷株中的可溶性表达 175

第五节 胰岛素样生长因子-Ⅰ基因的克隆与表达 175

二、重组高效表达载体的构建及rhIGF-Ⅰ的可溶性表达 177

第六节 纳豆激酶基因的克隆及其表达 178

第七节 人血管生成素基因的克隆及其表达 182

一、人血管生成素cDNA的克隆与融合表达 182

二、人血管生成素-PE40融合蛋白基因的克隆及表达 184

第八节 单链抗体-γ干扰素基因的克隆与表达 186

第十二章 生物药物基因的克隆及其在酵母菌中的表达 188

第一节 纳豆激酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达 188

第二节 双功能抗体基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达 192

第十三章 生物药物基因的克隆及其在昆虫中的表达 194

第一节 红细胞生成素基因的克隆及在家蚕体中的表达 194

第二节 人白细胞介素-12基因的克隆及在昆虫细胞中的表达 196

第十四章 生物药物基因的克隆及其在动物细胞中的表达 200

第一节 红细胞生成素的克隆及其在CHO-dhfr-细胞中的表达 200

第二节 bFGF基因的克隆及在成纤维和成骨细胞中的表达 202

第三节 tPA突变体基因的克隆及其在CHO细胞中的表达 204

第四节 以细胞因子重组质粒为佐剂的乙肝DNA疫苗的克隆及在COS-细胞表达 205

第五节 乙型肝炎表面抗原preS2SDNA疫苗的克隆及其在COS-1细胞表达 210

第六节 融合HBcAg基因和IL-2基因DNA疫苗的克隆及其在COS-7细胞表达 211

第十五章 基因工程菌和工程细胞的培养与发酵 215

第一节 基因工程细菌的培养与发酵 215

一、rhANG基因工程菌发酵条件的研究 215

二、治疗型乙型肝炎病毒DNA疫苗工程菌的培养与发酵生产 217

三、重组大肠杆菌的高密度发酵技术 220

第二节 基因工程酵母的培养与发酵 221

一、工程酵母表达HBscFv-IFNγ的发酵工艺优化 221

二、重组酵母表达纳豆激酶最佳发酵条件研究 223

三、基因工程酵母菌的高密度发酵 226

第三节 工程细胞的培养与发酵 227

第一节 影响分离纯化工艺设计的主要因素 229

第十六章 基因工程药物的分离纯化 229

第二节 各种产物表达形式采用的分离纯化方法 230

一、细胞内不溶性表达产物——包涵体 230

二、分泌型的表达产物 231

三、大肠杆菌细胞内可溶性表达产物 232

四、大肠杆菌细胞周质表达蛋白 232

第三节 基因工程药物的分离纯化实例 232

一、以包涵体形式表达的rGM-CSF中试分离纯化 232

二、重组人血管生长素包涵体的分离纯化 234

三、以分泌型表达的人α1干扰素的分离纯化 236

四、以可溶性形式表达的rhG-CSF的分离纯化 237

五、在酵母中表达的HBsAg的分离纯化 237

六、在酵母中表达HBscFv-IFNγ融合蛋白的分离纯化 238

二、基因工程药物的特点 241

一、主要的基因工程药物 241

第十七章 基因工程药物的分析与检验 241

第一节 基因工程药物的质量控制 241

三、基因工程药物的质量要求 242

四、基因工程药物的质控要点 243

五、基因工程药物的制造及检定规程 247

第二节 基因工程药物常用的检验方法 248

一、化学检定法 248

二、肽图分析法 248

三、外源性DNA残留量的测定 249

四、宿主细胞蛋白杂质的检测 250

五、无菌试验 252

六、内毒素试验 254

七、异常毒性试验 255

八、热原质试验 256

九、生物学活性（效价）检定 257

第三节 基因工程药物的分析检验举例 257

一、重组人干扰素的分析检验 257

二、重组人白细胞介素的分析检验 258

三、重组人红细胞生成素的分析检验 259

四、重组人集落刺激因子的检验 261

附录1 干扰素效价测定（细胞病变抑制法） 263

附录2 重组人白细胞介素-2效价测定（CTLL-2依赖细胞株／MTT比色法） 265

附录3 EPO体内活性测定（网织红细胞法） 266

附录4 EPO纯度测定（HPLC-SEC法） 267

附录5 CHO细胞蛋白残留量测定（ELISA法） 268

附录6 rhG-CSF效价测定（NFS-60依赖株／MTT比色法） 269

主要参考文献 270