世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册PDF电子书下载

第1章 背景 1

1．1 引言 1

1．2 关于第5版 1

1．3 手册的目的 2

第一部分 精液分析 5

第2章 标准程序 5

2．1 引言 5

2．2 标本采集 7

2．2．1 准备 7

2．2．2 以诊断或研究为目的的精液采集 8

2．2．3 用于辅助生殖的精液无菌采集 8

2．2．4 用于微生物学分析的精液无菌采集 8

2．2．5 在家采集精液 9

2．2．6 使用避孕套采集精液 9

2．2．7 标本的安全处理 9

2．3 初步肉眼观察 10

2．3．1 液化 10

2．3．2 精液的黏稠度 11

2．3．3 精液外观 11

2．3．4 精液体积 11

2．3．5 精液pH值 12

2．4 显微镜初检 13

2．4．1 精液充分混匀和代表性取样 13

2．4．2 制备湿片 13

2．4．3 精子聚集 14

2．4．4 精子凝集 15

2．4．5 非精子细胞成分 16

2．5 精子活力 16

2．5．1 精子运动分类 17

2．5．2 制备和评估精液样本的精子活力 17

2．5．3 样例 19

2．5．4 参考值下限 20

2．6 精子存活率 20

2．6．1 应用伊红-苯胺黑的精子存活率试验 20

2．6．2 单用伊红的精子存活率试验 22

2．6．3 应用低渗膨胀的精子存活率试验 23

2．7 精子数量 25

2．7．1 计数板类型 26

2．7．2 改良Neubauer血细胞计数板 26

2．7．3 使用血细胞计数板网格 27

2．7．4 计数板的保养 28

2．7．5 稀释精液的固定液 28

2．7．6 计数足够精子的重要性 28

2．8 常规计数程序 29

2．8．1 如何确定精液所需的稀释倍数 29

2．8．2 稀释精液样本并加入血细胞计数板的计数池中 31

2．8．3 评估计数池内的精子数目 32

2．8．4 计算精液中精子浓度 33

2．8．5 样例 33

2．8．6 精子浓度的参考值下限 34

2．8．7 计算每次射出精液的精子总数 35

2．8．8 精子总数的参考值下限 35

2．9 精子数目低的情况：隐匿精子症和可疑无精子症 35

2．10 当精子数目少且无需进行精确计数时 35

2．10．1 不做进一步处理 35

2．10．2 离心样本后检测精子 35

2．10．3 检测非离心标本中活动精子数目 36

2．11 当精子数目少且需要准确评估时 37

2．11．1 在整个改良Neubauer血细胞计数板计数池中评估精子数目少的样本（相差显微镜） 38

2．11．2 用一次性大容量计数板计数精子少的样本（荧光显微镜） 40

2．12 非精子细胞的计数方法 44

2．12．1 计数精液中圆细胞浓度 44

2．12．2 方法的灵敏度 44

2．12．3 样例 44

2．13 精子形态 45

2．13．1 正常精子的概念 45

2．13．2 精液涂片的制备 46

2．14 染色方法 49

2．14．1 传统的固定和染色方法 49

2．14．2 用于精子形态学分析的巴氏染色程序 49

2．14．3 用于精子形态学分析的Shorr染色程序 51

2．14．4 精子形态的快速染色程序 52

2．15 检查已染色的涂片 53

2．15．1 正常精子形态学的分类 53

2．15．2 异常精子形态学的分类 54

2．16 形态学彩图 55

2．17 精子形态学涂片的分析 84

2．17．1 正常精子形态的评估 84

2．17．2 样例 85

2．17．3 参考值下限 85

2．17．4 异常精子形态的评估 85

2．17．5 样例 86

2．17．6 特定精子缺陷的评估 86

2．18 精液中白细胞的评估 87

2．18．1 使用邻甲苯胺染细胞内过氧化物酶的步骤 87

2．19 精液中未成熟生殖细胞的评估 91

2．20 精子包被抗体的检测 91

2．20．1 混合抗球蛋白反应试验 92

2．20．2 直接免疫珠试验 94

2．20．3 间接免疫珠试验 96

第3章 可供选择的方案 98

3．1 多重精子缺陷指数 98

3．1．1 多重形态缺陷指数的计算 98

3．1．2 样例 98

3．2 全白细胞（CD45）免疫细胞化学染色 100

3．2．1 原理 100

3．2．2 试剂 100

3．2．3 步骤 101

3．3 精子-宫颈黏液的相互作用 103

3．3．1 体内试验（性交后试验） 103

3．3．2 体外试验 106

3．3．3 体外简化玻片试验 107

3．3．4 毛细管试验 108

3．4 附属性器官功能的生化测试 110

3．4．1 精浆锌的测定 110

3．4．2 精浆果糖的测定 112

3．4．3 精浆中性α-葡糖苷酶的测定 113

3．5 计算机辅助精子分析 115

3．5．1 引言 115

3．5．2 使用CASA评估精子的活力 116

3．5．3 CASA用于评估精子浓度 118

3．5．4 计算机辅助精子形态学计量分析 118

第4章 用于研究的方法 120

4．1 活性氧（reactive oxygen species，ROS） 120

4．1．1 引言 120

4．1．2 精子悬液活性氧的检测 121

4．2 人精子-卵母细胞相互作用试验 123

4．3 人卵透明带结合试验 124

4．4 顶体反应检测 124

4．4．1 顶体状态荧光检测方法的操作步骤 124

4．4．2 诱导顶体反应的检测 126

4．5 去透明带仓鼠卵穿透试验 128

4．5．1 方案 128

4．6 精子染色质的检测 132

第二部分 精子制备 135

第5章 精子制备技术 135

5．1 引言 135

5．1．1 精子从精浆中的分离 135

5．1．2 制备方法的选择 135

5．1．3 将精子与精浆和感染性微生物分离的效率 136

5．2 总则 136

5．3 简单的洗涤 136

5．3．1 试剂 136

5．3．2 程序 137

5．4 直接上游法 137

5．4．1 试剂 137

5．4．2 程序 137

5．5 非连续密度梯度法 138

5．5．1 试剂 138

5．5．2 程序 139

5．6 HIV感染精液标本的制备 139

5．7 睾丸和附睾精子的制备 139

5．7．1 酶学方法 140

5．7．2 机械方法 140

5．7．3 处理精子悬液用于ICSI 140

5．8 逆行射精标本的制备 140

5．9 辅助射精标本的制备 141

第6章 精子的冷冻保存 142

6．1 引言 142

6．2 精液冷冻保存方案 144

6．2．1 标准程序 144

6．2．2 少精子症标本和手术取精的冷冻方案 146

6．2．3 麦管的标记和记录 147

第三部分 质量保证 151

第7章 质量保证和质量控制 151

7．1 男科学实验室的质量控制 151

7．2 精液分析中误差的性质 151

7．3 减小统计学抽样误差 153

7．4 质量保证项目 153

7．5 实验室操作手册 153

7．6 内部质量控制 154

7．6．1 外购的QC样本 154

7．6．2 实验室自制的QC样本 154

7．6．3 储存的QC样本（外购或自制） 154

7．6．4 新鲜的QC样本（实验室自制） 155

7．7 分析和报告检测人员自身和之间的系统误差的统计学程序 156

7．7．1 Xbar图 156

7．7．2 S图 157

7．8 百分率的质控 159

7．9 评价Xbar和S图 159

7．9．1 如何识别失控值 159

7．9．2 失控的原因 160

7．9．3 对失控值的回应 160

7．10 分析和报告检测人员间差异的统计学程序 161

7．10．1 两个或两个以上检测人员之间结果比较 161

7．10．2 月均值的监控 164

7．11 外部质量控制和质量保证 164

7．11．1 EQC结果的评估 165

7．11．2 对失控结果的回应 165

7．12 QC的频率和优先考虑 165

7．13 培训 166

7．13．1 分析精子浓度遇到问题时的实用建议 166

7．13．2 精子形态学分析遇到问题时的实用建议 167

7．13．3 精子活力分析遇到问题时的实用建议 168

7．13．4 精子存活率分析遇到问题时的实用建议 169

参考文献 171

附录 191

附录1 参考值和精液术语 191

A1．1 参考值 191

A1．2 术语 193

附录2 设备与安全 195

A2．1 男科学实验室需的基本配置 195

A2．2 男科学实验室的潜在生物危害 197

A2．3 实验室人员的安全操作规程 197

A2．4 实验室仪器的安全使用规程 199

A2．5 操作液氮时的安全措施 199

附录3 显微镜的使用 201

A3．1 加样 201

A3．2 调整目镜位置 202

A3．3 图像聚焦 202

A3．4 目镜聚焦 203

A3．5 调光源聚光器的焦距 203

A3．6 校正聚光器中心 203

A3．7 相位环的调节 204

A3．8 荧光显微镜 204

附录4 储备溶液 205

A4．1 Biggers,Whitten和Whittingham 205

A4．2 Dulbeccos磷酸盐缓冲液 205

A4．3 Earle'S培养液 206

A4．4 Ham's F-10培养液 206

A4．5 Hanks'平衡盐溶液 206

A4．6 人类输卵管液 207

A4．7 Krebs-Ringer培养基 207

A4．8 Tris缓冲液 207

A4．9 Tyrode's溶液 208

A4．10 Papanicolaou染色液 208

附录5 宫颈黏液 211

A5．1 引言 211

A5．2 宫颈黏液的采集和保存 212

A5．3 宫颈黏液的评估 212

附录6 精液和宫颈黏液分析记录表格 216

A6．1 精液分析记录表格模板 216

A6．2 宫颈黏液记录表格模板 218

附录7 抽样误差和质量控制 219

A7．1 精子浓度测定中的误差 219

A7．2 了解抽样误差的重要性 220

A7．3 百分率测定中的误差 221

A7．4 用于质量控制的精液样本制备 224

A7．5 制作视频录像用于精子活力分析的内部质量控制 224

A7．6 制备稀释精液用于评估精子浓度的内部质量控制 228

A7．7 精子形态学评估内部质量控制涂片的制备 230

A7．8 设备校准 231

附录8 精液分析的国家外部质量控制项目 233

图 6

图2-1 在1年半期间精子总数和精子浓度的变异 6

图2-2 精液中精子的非特异性聚集 14

图2-3 精子不同凝集程度的示意图 15

图2-4 辅助评估精子活力 18

图2-5 在亮视野显微镜下观察伊红-苯胺黑涂片 22

图2-6 人精子在低渗透压作用下的特征性形态变化的示意图 24

图2-7 改良Neubauer血细胞计数板 26

图2-8 网格中方格的精子计数 27

图2-9 观察整个盖玻片区域寻找活动精子 37

图2-10 “正常”形态精子 45

图2-11 用于精子形态学分析的精液涂片方法 47

图2-12 制备一张正常精液的涂片 47

图2-13 人精子一些异常形态的示意图 55

图2-14 人精液中过氧化物酶阳性与阴性细胞 88

图3-1 精液中的白细胞 102

图3-2 Kremer精子穿透计 108

图3-3 CASA系统检测参数的标准术语 117

图4-1 酵母多糖刺激白细胞产生的化学发光信号 122

图4-2 细胞悬液中白细胞和精子的活性氧产生的相对量 123

图4-3 人精子豌豆凝集素（PSA）荧光染色 126

图4-4 含有人精子的去卵透明带仓鼠卵母细胞的相差显微镜照片 132

图7-1 精子浓度的Xbar图 158

图7-2 精子浓度S图 159

图7-3 前向运动精子百分率的人工和CASA测量值Bland-Altman图 161

图7-4 精子浓度测量值Youden图 162

图A2-1 根据转子半径和转速测定相对离心力（RCF）的列线图 198

图A5-1 玻片上干燥的宫颈黏液羊齿状结晶形成示例 211

图A7-1 根据评估的精子总数得出的两次重复计数之间的可接受差异 220

图A7-2 对应于真实百分率和所测精子总数的两次重复测量所得百分率之间的可接受差异 222

图A7-3 辅助评估精子活力 226

图A7-4 通过带有网线（红色栅格）的目镜观察 227

图A7-5 监视器上显示的镜台测微尺录像和覆盖在监视器上的绘制栅格，说明见文内 228

方框 8

方框2-1 证实精液采集容器的相容性 8

方框2-2 菠萝蛋白酶的准备 11

方框2-3 充分混匀精液 14

方框2-4 制备湿片的深度 14

方框2-5 评估百分率的误差 19

方框2-6 重复百分率的比较 19

方框2-7 评估精子数目的误差 28

方框2-8 在改良Neubauer血细胞计数池的中央3个网格对每个重复样本计数200个精子 29

方框2-9 20μm深的湿片，每高倍镜视野所观察的精液体积 30

方框2-10 重复计数的比较 33

方框2-11 每个样本在改良Neubauer血细胞计数板的全部9个网格计数达到200个精子 38

方框2-12 在100μm深的大容量一次性计数板上，每个重复样本可计数达到200个精子 41

方框2-13 在100μm深的大容量一次性计数板上，每高倍镜视野观察到的体积 42

方框2-14 封片剂 49

方框3-1 蜡-凡士林混合物的制备 104

方框3-2 在制备的100μm厚度黏液玻片中每个高倍视野所观察的体积 105

方框4-1 诱发仓鼠排卵 129

方框4-2 制备玻璃移液管 131

方框6-1 精液冷冻保存的原因 143

方框6-2 人精液冷冻保存的风险评估 144

方框7-1 质量保证和质量控制术语 152

方框7-2 确定XBar图的警戒限和处置限 157

方框7-3 计算XBar控制限的另一方法：由合并标准差计算 157

方框7-4 确定S图的警戒限和处置限 158

方框7-5 质控图的基本控制规则 160

方框7-6 评估检测人员之间的系统性差异 163

方框7-7 IQC的主要特性 164

方框7-8 QC日程表 166

方框7-9 QC检验概要 166

方框A2-1 离心力的计算 197

方框A3-1 物镜 202

方框A5-1 测定采集到的宫颈黏液体积 213

方框A5-2 厚度100μm的黏液制片每高倍视野的体积 214

表 19

表2-1 从重复计数200个精子（总共计数400个精子）确定所给出平均值的两个百分率之间的可接受差异 19

表2-2 根据计数的精子总数四舍五入的取样误差（％） 29

表2-3 精液标本所需的稀释倍数，如何进行稀释，使用的计数板和可能评估的区域 30

表2-4 对于一定总数的两个重复计数可接受的差异 32

表2-5 对于一定总数的两次计数之间可接受的差异：低精子浓度 39

表2-6 精子形态学彩图中注释的解释 56

表2-7 用于免疫珠试验的精液量 94

表3-1 多重精子缺陷指数的计算 99

表3-2 生育和不育夫妇中男性的精子缺陷指数 99

表3-3 精子穿透密度的等级顺序 109

表3-4 毛细管试验结果的分级 109

表7-1 XBar图和基于平均标准差（XBar）的S图的控制限的决定因素 156

表7-2 精子浓度分析时变异（误差）的来源和建议的解决方案 167

表7-3 精子形态学分析时变异（误差）的来源和推荐的解决方案 168

表7-4 精子活力分析时变异（误差）的来源和建议的解决方案 168

表7-5 精子存活率分析时变异（误差）的来源和推荐的解决方案 169

表A1-1 精液特性的参考值下限（第5个百分位数，95％可信区间） 192

表A1-2 源自性伴侣在停止使用避孕措施后12个月内怀孕的男性精液参数值的分布 192

表A1-3 与精液质量相关的术语 193

表A7-1 对应于特定总数的两次重复计数之间的可接受差异 220

表A7-2 对应于重复计数100个（总共200个）精子所得到的平均百分率，两次评估值之间的可接受差异 223

表A7-3 对应于重复计数200个（总共400个）精子所得到的平均百分率，两次评估值之间的可接受差异 223

表A7-4 对应于重复计数400个（总共800个）精子所得到的平均百分率，两次评估值之间的可接受差异 224