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第1章 绪论 1

1.1 引言 1

1.2 蛋白质纯化方法 2

1.2.1 蛋白质与小分子纯化方法的比较 2

1.2.2 蛋白质常用纯化方法 2

1.2.3 蛋白质的分离工艺过程 5

1.2.4 纯化工艺设计基本原则 7

1.2.5 蛋白质纯化常用仪器和试剂 8

1.2.6 蛋白质纯化应注意的事项 10

1.3 蛋白质样品制备技术 11

1.3.1 原材料的选择 11

1.3.2 原材料的破碎技术 13

1.3.3 样品的提取 14

1.3.4 样品的回收 15

1.3.5 提取液的处理技术 17

1.4 蛋白质的沉淀分离技术 23

1.4.1 盐析法 23

1.4.2 有机溶剂沉淀法 28

1.4.3 其他沉淀法 31

1.5 膜分离技术在蛋白质纯化中的应用 32

1.5.1 概述 32

1.5.2 膜分离技术的分离原理及膜产品种类 33

1.5.3 膜技术生物分离中的应用 35

参考文献 38

第2章 色谱法分类及理论 39

2.1 色谱分类及装置 39

2.1.1 色谱分类方法 39

2.1.2 经典柱液相色谱技术 42

2.1.3 高效液相色谱技术 45

2.1.4 工业制备液相色谱技术 52

2.1.5 经典色谱、高效色谱、制备色谱三者间的关系 56

2.2 固定相 57

2.2.1 基质 58

2.2.2 填料的形状、大小、孔径、结构及分布 70

2.2.3 配基 73

2.3 流动相 74

2.3.1 对流动相的一般要求 75

2.3.2 流动相的主要性质 75

2.4 基本理论 76

2.4.1 保留值 76

2.4.2 柱效能指标 78

2.4.3 分离效能总指标 81

参考文献 86

第3章 离子交换色谱 88

3.1 引言 88

3.2 离子交换作用 89

3.2.1 溶液中蛋白质的带电状况 89

3.2.2 离子交换 92

3.3 离子交换色谱保留机理 94

3.3.1 静电作用保留模型 94

3.3.2 计量置换保留模型 95

3.4 离子交换填料 97

3.4.1 离子交换填料的结构与分类 97

3.4.2 离子交换填料的种类 99

3.5 离子交换色谱填料的合成 108

3.5.1 硅胶基体离子交换填料的合成 108

3.5.2 高分子聚合物基体离子交换填料的合成 110

3.5.3 琼脂糖基体离子交换填料的合成 111

3.5.4 交联葡聚糖基体离子交换填料的合成 112

3.5.5 纤维素基体离子交换填料的合成 113

3.6 离子交换填料的性能及检测 114

3.6.1 外观 114

3.6.2 粒径分布测定 114

3.6.3 最大耐压和最大流速的测定 115

3.6.4 交换容量的测定 116

3.6.5 蛋白质吸附量的测定 117

3.7 离子交换色谱条件的选择 118

3.7.1 色谱填料的选择 118

3.7.2 柱子的选择 122

3.7.3 流动相选择 122

3.7.4 洗脱模式 127

3.7.5 其他色谱条件 128

3.8 离子交换色谱的应用 129

3.8.1 色谱技术 129

3.8.2 硅胶基体离子交换色谱应用实例 132

3.8.3 多糖基体离子交换色谱应用实例 134

3.8.4 规模放大的色谱条件 137

3.8.5 IEC在蛋白质折叠复性中的应用 138

3.9 离子交换色谱中蛋白质的累加进样分离法 139

3.9.1 离子交换色谱中蛋白质洗脱曲线有突跃 139

3.9.2 离子交换色谱中蛋白质的累加进样分离法 139

3.9.3 离子交换色谱中蛋白质的累加进样分离法浓集样品 140

3.9.4 离子交换色谱中蛋白质的选择性保留分离法 141

3.10 多模式离子交换色谱 141

参考文献 143

第4章 亲和色谱 145

4.1 引言 145

4.2 基本原理 145

4.3 亲和色谱填料 147

4.3.1 基体 148

4.3.2 配体 150

4.3.3 间隔臂 153

4.4 亲和色谱填料的制备 153

4.4.1 亲和色谱合成路线 153

4.4.2 多糖基体亲和色谱填料的制备 155

4.4.3 硅胶基体亲和色谱填料的制备 171

4.4.4 亲和色谱填料的性能评价 172

4.4.5 已商品化的多糖基体亲和色谱填料及中间体 172

4.5 若干类型亲和色谱介绍 174

4.5.1 固定金属离子亲和色谱 175

4.5.2 染料亲和色谱 180

4.5.3 凝集素亲和色谱 186

4.5.4 生物专一性亲和色谱 189

4.5.5 共价亲和色谱 190

4.5.6 磁性亲和色谱 193

4.6 亲和色谱操作技术 197

4.6.1 样品制备 197

4.6.2 装柱及平衡 197

4.6.3 上样及洗涤 198

4.6.4 洗脱 198

4.6.5 再生 199

4.6.6 柱子的保存 200

4.7 亲和色谱的应用 200

4.7.1 生物大分子分离纯化和分析中的应用 200

4.7.2 临床检测和治疗中的应用 204

4.7.3 活性细胞膜色谱的应用 204

4.7.4 食品安全性检查和农药残留检测中的应用 205

参考文献 205

第5章 排阻色谱 207

5.1 引言 207

5.2 排阻色谱原理 208

5.3 排阻色谱固定相 210

5.3.1 排阻色谱柱的参数 210

5.3.2 排阻色谱填料的要求及种类 211

5.3.3 葡聚糖凝胶 213

5.3.4 琼脂糖凝胶 214

5.3.5 硅胶基体凝胶 215

5.3.6 聚丙烯酰胺凝胶 216

5.3.7 复合凝胶Sephacryl和Superdex 217

5.3.8 有机高分子类凝胶 219

5.4 排阻色谱条件 219

5.4.1 柱子填料 219

5.4.2 柱子尺寸 221

5.4.3 洗脱模式及流动相 221

5.4.4 流速 222

5.4.5 上样量 223

5.5 排阻色谱的一般操作 223

5.5.1 排阻色谱凝胶的准备 223

5.5.2 排阻色谱的操作 224

5.6 排阻色谱的应用 227

5.6.1 蛋白质等大分子的分离纯化 227

5.6.2 大分子的脱盐和脱小分子物质 229

5.6.3 分子量测定 229

5.6.4 排阻色谱用于蛋白质复性 231

5.6.5 缓冲溶液的交换 233

5.6.6 浓缩蛋白质溶液 233

5.6.7 用排阻色谱测定蛋白质的构象转化点 233

参考文献 234

第6章 反相色谱 236

6.1 反相色谱保留机理 236

6.1.1 疏溶剂化理论 236

6.1.2 计量置换模型 238

6.1.3 双保留机理 239

6.2 反相色谱的固定相 241

6.2.1 常用反相色谱的固定相 241

6.2.2 反相色谱固定相的合成 244

6.3 反相色谱流动相 245

6.4 蛋白质反相色谱实验条件的选择 246

6.4.1 蛋白质反相色谱的固定相及柱子选择 246

6.4.2 蛋白质反相色谱的流动相选择 247

6.4.3 蛋白质反相色谱的柱子温度对保留值的影响 249

6.4.4 蛋白质反相色谱的洗脱方式 249

6.4.5 上样量对保留值和分离度的影响 250

6.4.6 检测 251

6.5 反相色谱的应用 251

6.5.1 蛋白质反相色谱中的突跃及累加进样 251

6.5.2 反相色谱在蛋白质分离中的应用 252

6.5.3 肽图及氨基酸序列分析&. 253

6.5.4 酶活性测定 255

6.5.5 HPRPC的高效分离 255

6.5.6 蛋白质构象变化的研究 255

6.5.7 蛋白质样品脱盐 256

参考文献 256

第7章 疏水作用色谱 258

7.1 引言 258

7.2 蛋白质的亲水性和疏水性基团 258

7.3 疏水作用色谱保留机理 259

7.3.1 疏溶剂化理论 259

7.3.2 熵增原理 260

7.3.3 计量置换模型 260

7.3.4 溶质和配基之间的界面自由能变化决定洗脱和吸附 261

7.4 疏水作用色谱填料 261

7.4.1 疏水作用色谱填料的构成 261

7.4.2 商品化疏水作用色谱填料 263

7.5 疏水作用色谱填料的合成 263

7.5.1 硅胶基体疏水作用色谱填料的合成 263

7.5.2 多糖基体疏水作用色谱填料的合成 265

7.6 疏水作用色谱填料的性能及检测 267

7.6.1 外观 267

7.6.2 粒径分布测定 267

7.6.3 最大耐压和最大流速的测定 267

7.6.4 蛋白质吸附量的测定 267

7.6.5 配基密度的测定 268

7.6.6 蛋白质活性回收率测定 269

7.7 疏水作用色谱条件的选择及对分离的影响 270

7.7.1 色谱填料的选择 271

7.7.2 柱子的选择 271

7.7.3 流动相的选择 272

7.7.4 温度对色谱的影响 274

7.7.5 洗脱模式 274

7.7.6 疏水色谱与反相色谱的关联 275

7.8 疏水作用色谱的应用 278

7.8.1 疏水作用色谱技术 278

7.8.2 疏水作用色谱的应用实例 280

7.9 HIC中蛋白质的累加进样分离法 284

参考文献 286

第8章 新型色谱和其他分离技术简介 288

8.1 扩张床吸附技术 288

8.1.1 扩张床吸附技术简介 288

8.1.2 扩张床吸附技术中使用的介质 288

8.1.3 扩张床吸附技术中使用的柱子 290

8.1.4 扩张床吸附技术的操作 291

8.1.5 扩张床吸附技术的应用 293

8.1.6 扩张床吸附技术的应用实例 293

8.2 多维液相色谱 294

8.2.1 多维液相色谱基本概念 294

8.2.2 多维液相色谱的相关技术 295

8.2.3 多维液相色谱的应用 298

8.3 径向色谱 299

8.3.1 径向色谱的原理 299

8.3.2 径向色谱的特点 300

8.3.3 径向色谱的应用 300

8.4 膜色谱 302

8.4.1 膜色谱的原理和特点 302

8.4.2 膜色谱的介质及色谱柱 302

8.4.3 膜色谱的应用 305

8.5 灌注色谱 307

8.5.1 灌注色谱法的产生 307

8.5.2 灌注色谱法的原理及特点 308

8.5.3 灌注色谱法的应用 311

8.6 逆流色谱 313

8.6.1 逆流色谱的发展与仪器 313

8.6.2 逆流色谱的分离原理 315

8.6.3 逆流色谱在蛋白质分离中的应用 317

8.7 整体柱色谱技术 319

8.7.1 整体柱色谱技术简介 319

8.7.2 整体柱色谱的柱子 320

8.7.3 整体柱色谱的应用 322

参考文献 324

第9章 制备液相色谱技术 327

9.1 分离条件评估参数 328

9.1.1 负载量 329

9.1.2 制备色谱分离效果的评估 330

9.2 制备色谱装备的相关技术 330

9.2.1 制备色谱柱筛板及流动相出入口选择 330

9.2.2 制备色谱柱的装填技术 331

9.2.3 制备色谱中的污染问题 333

9.2.4 进样 334

9.2.5 检测器 335

9.2.6 自动化系统 335

9.2.7 几个典型的制备色谱系统 335

9.3 最佳化纯化条件建立 336

9.3.1 影响色谱柱最大负载量的因素 337

9.3.2 提高工业制备色谱处理量的方法 338

9.3.3 样品的负载与回收率纯度间的关系 341

9.4 色谱技术之间的相容性选择原则 342

9.4.1 不同纯化阶段色谱技术选用原则 342

9.4.2 不同色谱技术的相容性 343

9.4.3 不同纯化技术与蛋白质色谱纯化技术组合的要求 344

9.5 短柱制备色谱技术 345

9.6 蛋白质纯化的精品更精技术 347

9.7 制备色谱在蛋白质纯化方面的应用 348

9.7.1 色谱法分离血液制品 348

9.7.2 胰岛素的制备色谱纯化 351

9.7.3 疫苗的制备色谱纯化 352

9.7.4 制备HPLC的应用 355

参考文献 356

第10章 蛋白质的保存技术 358

10.1 影响蛋白质保存稳定的因素 359

10.1.1 空气 359

10.1.2 温度 359

10.1.3 水分 360

10.1.4 光线 360

10.1.5 样品的pH 360

10.1.6 时间 360

10.1.7 蛋白质本身性质改变 360

10.1.8 保护剂的作用 360

10.2 蛋白质的保存方法 361

10.2.1 低温保存 362

10.2.2 在稳定pH下保存 363

10.2.3 在高浓度下保存 364

10.2.4 在保护剂存在下保存 366

10.3 固态保存 372

10.3.1 制成干粉或结晶 372

10.3.2 制成水不溶酶 373

10.3.3 蛋白质的玻璃化保存技术 373

10.3.4 制成酶衍生物 374

10.3.5 冷冻干燥 374

10.4 冷冻干燥技术 375

10.4.1 冷冻干燥的原理和作用 375

10.4.2 实验室制备冻干品的简易方法 376

10.4.3 工业生产的冷冻干燥系统 377

10.4.4 冷冻干燥对蛋白质活性的影响 380

10.4.5 保护剂的作用 381

参考文献 387

第11章 蛋白质样品鉴定技术 388

11.1 蛋白质的定量 388

11.1.1 蛋白质的HPLC法定量 389

11.1.2 单波长紫外分光光度法定量 390

11.1.3 多波长紫外分光光度法定量 391

11.1.4 凯氏定氮法 392

11.1.5 双缩脲法 392

11.1.6 考马斯亮蓝染色法 393

11.1.7 Lowry法 394

11.1.8 二喹啉甲酸法 394

11.1.9 由蛋白质总活性定量 395

11.2 蛋白质纯度分析 396

11.2.1 紫外光度法 396

11.2.2 超速离心沉降法 396

11.2.3 凝胶电泳法 396

11.2.4 色谱法 403

11.2.5 活性对照法 403

11.2.6 等电聚焦 403

11.2.7 其他检测法 404

11.3 蛋白质的定性表征 404

11.3.1 蛋白质定性的依据 404

11.3.2 蛋白质的电泳定性及分子量测定 405

11.3.3 蛋白质的色谱定性和分子量测定 405

11.3.4 蛋白质的质谱 405

11.3.5 蛋白质的氨基酸序列测定 409

11.3.6 蛋白质的等电点测定 410

11.3.7 蛋白质的肽谱 411

11.3.8 蛋白质中糖含量分析 412

11.3.9 蛋白质的生物活性测定 415

参考文献 416