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第一章 病毒的形态与结构及电镜鉴定原则 1

第一节 病毒的大小与形态 1

一、病毒的大小概念 1

第一篇 病毒学基础知识 1

二、病毒的形态特征 2

第二节 病毒的结构与功能 2

一、病毒的基本结构与功能 2

二、病毒的特殊结构与功能 3

第三节 病毒结构的对称性 4

一、立体对称型病毒 4

二、螺旋对称型病毒 5

三、复合对称型病毒 5

第四节 病毒的电镜鉴定标准和脊椎动物病毒的分类原则 5

一、超级寄生的定义与原理 21

二、超级寄生律的应用举例 21

第一节 病毒的超级寄生律 21

第二章 病毒的生活规律及其利用与控制 21

第二节 病毒的自我复制繁殖律 23

一、病毒繁殖的基本过程 23

二、DNA病毒的繁殖机理 24

三、单股正链小RNA病毒的繁殖机理 25

四、单股负链大RNA病毒的繁殖机理 26

二、病毒的人工定向变异 27

一、病毒遗传与变异的基本特点 27

第三节 病毒的遗传与变异律 27

第三章 病毒的致病与免疫原理 29

第一节 病毒的致病特点 29

一、引起细胞破坏与死亡 29

二、致使细胞呈持续感染状态 30

三、导致细胞转化与癌变 31

第二节 病毒的免疫特点 31

一、机体抗病毒的胞外免疫力 31

一、干扰素的定义与各类 33

第三节 干扰素的基本概念 33

二、机体抗病毒的胞内免疫力 33

三、两种免疫的强度与持久性 33

二、干扰素的基本特性 34

六、冠状病毒科(Coronaviridae) 34

三、干扰素诱生剂简介 35

四、干扰素的产生机理 36

五、干扰素的抗病毒机理 36

第四章 病毒的分类现状 38

第一节 分类基础与概要 38

一、分类基础 38

二、分类概要 38

第二节 DNA病毒类(门) 39

一、微病毒科(Parvoviridae) 39

二、乳多空病毒科(Papovaviridae) 39

第三节 RNA病毒类(门) 40

一、小RAN病毒科(Picornaviridae) 40

五、痘病毒科(Poxviridae) 40

四、疱疹病毒科(Herptoviridae) 40

三、腺病毒科(adenoviridae) 40

二、呼肠孤病毒科(Reoviridae) 41

三、虫媒病毒群(Arbovirus) 41

四、披盖病毒科(Togaviridae) 41

五、嵌沙样病毒科(Arenaviridae) 42

十、副粘病毒科(Paramyxoviridae) 43

九、正粘病毒科(Orthomyxoviride) 43

八、本雅病毒科(Bunyaviridae) 43

七、逆转录病毒科(Rotroviridae) 43

十一、弹状病毒科(Rabdoviridae) 44

十二、未分类的主要病毒 44

十三、类病毒(Viroid?) 44

第二篇 病毒的血清学诊断方法 45

第五章 补体综合试验方法 45

第一节 鼠脑内繁殖病毒法 45

一、干燥毒株鼠脑内传代繁殖法 45

二、感染小白鼠的观察 46

一、感染小白鼠的饲养管理 46

第二节 感染小白鼠的饲养观察及取脑方法 46

二、低温保存感染鼠脑悬液的制备及鼠脑内传代繁殖法 46

三、感染鼠脑剖取法 47

第三节 抗原制备方法 47

一、丙酮-乙醚浸提法 47

二、待检血清制备法 50

第五节 羊血球及溶血素的制备与滴定法 50

一、羊血球制备法 50

二、溶血素制备法 51

三、溶血素滴定法 52

五、溶血素应用液的配制法 53

四、溶血素单位的判定与保贮 53

一、补体制备法 54

第六节 补体的制备与滴定法 54

二、补体滴定法 54

第七节 抗原滴定法 56

一、方阵滴定法 56

第四节 免疫血清与待检血清制备法 59

二、蔗糖-丙酮浸提法 59

二、“直线”滴定法 59

第八节 补体综合试验 59

一、补体结合试验程序 59

二、补体结合试验方法 59

一、免疫血清制备法 59

一、抗原浸提与稀释用液的配制 63

二、红血球保存液的配制 63

第六章 血凝与血凝抑制试验方法 63

第一节 试验前的各项准备工作 63

三、不同PH血球稀释液的配制 64

四、白陶土处理法 64

五、血清处理法 65

六、血凝素抗原制备法 65

七、鹅血球悬液的制备法 66

二、血凝与血凝抑制试验的操作方法与技术 67

一、血凝及血凝抑制试验程序 67

第二节 试验方法与技术 67

第三节 血凝与血凝抑制试验方面的几个主要问题 75

一、各种病毒的血凝特点 75

二、几种虫媒病毒的血凝特点 75

三、乙脑病毒血凝与血凝抑制特点 76

第七章 中和试验方法 80

第一节 试验前病毒LD50测定 80

一、病毒悬液制备及稀释法 80

二、小白鼠接种及观察法 81

三、半数致死量(LD50)计算法 81

第二节 流乙脑炎病毒小白鼠中和试验 83

一、流乙脑炎病毒小白鼠中和试验程序 83

二、流乙脑炎病毒小白鼠中和试验法 84

三、小白鼠脑内感染法 85

四、观察结果及计算方法 85

二、组织培养中和试验 86

一、主要影响因素 86

第三节 应注意的几个问题 86

第三篇 病毒的细胞培养实验技术 88

第八章 细胞培养器材处理法 88

第一节 玻璃器材处理法 88

一、处理方法 88

二、注意事项 88

一、橡皮塞处理法 89

二、解剖器械处理法 89

第二节 橡皮塞及解剖器械处理法 89

第九章 平衡盐溶液的基本知识及配制方法 90

第一节 平衡盐溶液的基本知识 90

一、平衡盐溶液的种类与作用 90

二、实际用途及配制要求 90

第二节 常用平衡盐溶液的配法 90

一、Hanks 平衡盐溶液配制法 90

二、Earle s平衡盐溶液配制法 91

二、小量配制法 93

一、大量配制法 93

第一节 0.5%酚红配制法 93

第十章 细胞培养常用试液配制法 93

第二节 7.5%NaHCO3配制法 94

第三节 0.2%中性红配制法 94

第四节 抗生素配制法 94

一、青链双抗配制法 94

二、卡那霉素配制法 94

三、二性霉素乙配制法 94

第五节 1%胰蛋白酶配制法 95

第六节 0.02%乙二胺四乙酸二钠溶液配制法 95

第七节 血液的作用及选择与注意事项 95

一、血清的作用 95

二、血清的选择 95

三、注意事项 95

二、储存液配制方法 96

一、基本原理与原则 96

第十一章 常用培基原理及其配制法 96

第一节 Fagle s培基的基本原理及配制法 96

三、储存液分装与保存法 97

四、应用液稀释法 97

一、基本原理 97

第三节 RPMI-1640培基配制 98

二、配法 98

一、来源 98

二、配制方法 98

第十二章 单层细胞培养法 99

第一节 鸡胚纤维母细胞培养法 99

第二节 地鼠肾细胞培养法 100

第三节 原代人胚肌皮细胞培养法 100

第四节 猪肾细胞传代培养法 101

第五节 培养细胞的传代及液氮保贮与复苏法 101

一、传代 101

一、病毒感染细胞的分布规律 102

第一节 病毒感染细胞的分布及滴度计算 102

第十三章 病毒在细胞上的感染性滴定 102

二、液氮保贮 102

三、复苏 102

二、病毒感染细胞的三种情况 103

三、病毒样品感染滴度的侧定 104

第二节 病毒的空斑形成试验 105

一、基本概念 105

二、材料准备 106

三、操作方法 106

四、结果观察与计算 106

五、注意事项 107

第三节 病毒的细胞致病效应实验(微量试验法) 107

一、基本概念 107

二、实验方法 108

三、观察结果 108

第十四章 水泡性口炎病毒及新城鸡瘟病毒的增殖与滴定 109

一、基本概念 109

第一节 VSV的增殖与滴定 109

四、注意事项 109

二、VSV的扩增与保贮 110

三、VSV效价滴定 110

四、注意事项 111

第二节 新城鸡瘟病毒的扩增与滴定 111

一、基本概念 111

二、传代增殖法 111

三、血凝试验法 112

四、注意事项 112

第四篇 病毒的免疫荧光技术 113

第十五章 试剂的配制 113

第一节 有关缓冲液的配制 113

一、磷酸盐缓冲液(PBS) 113

二、0.5M碳酸盐缓冲液(PH9.0～9.5) 114

三、0.05M甘氨酸-HCI缓冲液 114

四、醋酸盐缓冲液(0.2M) 114

三、肝粉制备 115

二、0.02%伊文思蓝液的配制 115

一、纳氏试剂 115

第二节 饱和硫酸铵溶液的配制 115

五、Tris-HCI缓冲液(0.05M) 115

第三节 其他试剂的配制 115

四、福氏(Freund)佐剂的制备 116

五、聚乙烯醇-甘油胶的制备(异硫氰酸荧光素染色封片用) 116

六、聚苯乙烯胶(PX胶)的制备(罗丹明荧光素染色封片用) 116

第十六章 免疫血清的制备 117

第一节 病毒抗血清的制备方法(以乙脑为例) 117

一、抗原制备 117

二、免疫方法 117

第二节 间接法免疫血清的制备 117

一、球蛋白的提取 117

二、免疫过程 118

第十七章 免疫血清球蛋白的提取及纯化方法 119

第一节 硫酸铵盐析法 119

一、用Sophadex G50或G25柱去除法 120

二、透析法 120

第二节 凝胶过滤法及铵离子的去除 120

第三节 DEAE-纤维素层析纯化法 121

一、DEAE-纤维素层析法的原理 121

二、DEAE-纤维素柱的制备 122

三、加样与洗脱 122

四、洗脱物的浓缩方法 122

五、DEAE-纤维素的再生 122

一、试剂配制 123

第一节 缩脲法 123

第十八章 蛋白质含量的测定 123

二、测定步骤 124

第二节 Folin-酚试剂法 124

一、原理 124

二、试剂配制 124

三、测定方法 124

四、标准曲线的绘制 125

第三节 紫外光吸收法 126

二、电泳 127

一、制备琼脂板 127

第十九章 抗体球蛋白纯度分析法 127

第一节 免疫电泳(微量琼脂免疫电泳) 127

三、染色 128

第二节 醋醋纤维膜免疫电泳 128

一、醋酸纤维膜的制备方法 128

二、醋醋纤维膜电泳 128

三、结果判断 129

四、注意事项 129

第二十章 抗体效价的测定方法 129

第一节 环状沉淀试验 129

一、稀释抗原法 129

二、稀释抗体法 130

第二节 双向琼脂扩散 130

一、原理 130

二、实验方法 130

三、结果观察与分析 130

三、逆向免疫扩散法及标准曲线的制备 131

二、免疫吸附柱纯化羊抗兔IgG 131

四、未知标本免疫活性抗体蛋白量的测定 131

第三节 逆向扩散及抗体定量 131

一、正常兔IgG(纯品)的提取 131

第二十一章 胃酶水解抗体IgG提取F(ab )2法 132

第一节 材料与方法 132

一、材料 132

二、方法 132

第二节 注意事项 133

一、蛋白浓度的测定 133

二、F(ab )2的产率 133

三、IgG与胃酶的比例 133

四、F(ab )2的产率及纯度 133

第二十二章 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(连续系统)测定蛋白质分子量 133

第一节 基本原理 133

第二节 器材与试剂 133

二、液体配制 134

一、参考蛋白 134

第三节 参考蛋白与液体配制 134

一、器材 134

二、试剂 134

第四节 样品处理及配胶加样 135

一、样品处理 135

二、配胶 135

三、加样 135

第五节 电泳及其它 135

一、电泳 135

二、剥胶与固定 136

三、染色 136

四、蛋白迁移率测定 136

五、层析扫描纯度分析 136

第一节 荧光素 137

一、异硫氰酸荧光黄(FITC) 137

二、罗达明丽丝胺(RB200) 137

第二十三章 荧光抗体的制备及纯化 137

第二节 抗体与荧光素的标记 138

四、异硫氰酸四乙基罗达明(RBITC) 138

一、概述 138

三、异硫氰酸四甲基罗达明(TMRITC) 138

三、异硫氰酸四乙基罗达明(RBITC)的标记方法 139

四、罗达明丽丝胺标记方法 139

二、FITC的标记方法 139

一、分步洗脱 140

第三节 荧光抗体的纯化 140

二、梯度洗脱 140

五、异硫氰酸四甲基罗达明标记方法 140

四、计算F/P值的方法 141

三、荧光素含量测定(F值测定) 141

第五节 荧光素标准曲线的绘制 141

一、异硫氰酸荧光黄定量测定标准曲线的绘制 141

二、蛋白质测定(P) 141

一、影响标记抗体特征的主要因素 141

第四节 荧光抗体的鉴定 141

二、罗达明荧光素定量测定标准曲线的绘制 142

第六节 荧光抗体染色效价的测定与保贮 143

一、特异性测定 143

三、棋盘滴定 144

四、荧光抗体的保贮 144

二、工作稀释度测定 144

第二节 鼠脑标本的制备 145

二、多点细胞滴片标本的制备 145

一、冷冻切片 145

二、石腊切片 145

一、单层细胞小玻片标本的制备 145

第一节 组织培养标本的制备 145

第二十四章 荧光抗体染色标本的制作 145

三、鼠脑及尸检材料印片 146

第三节 标本的固定 146

一、直接染色法 147

第一节 荧光抗体染色法 147

二、间接染色法 147

第二十五章 荧光抗体的染色法及观察 147

第四节 标本的保存 147

一、镜检 149

第二节 镜检及结果判定 149

二、结果判断 149

四、封片 149

三、双标记染色法 149

第一节 荧光显微镜的构造 150

一、光学系统 150

第二十六章 荧光显微镜及其使用 150

二、机械系统 156

三、物镜倍数调节 157

二、聚光器的调整 157

四、标本的移动 157

五、电源开关 157

一、目镜聚焦 157

第二节 荧光显微镜的使用方法 157

三、对保管人员的基本要求 158

二、荧光显微镜的擦试要求 158

四、荧光显微镜使用时的注意事项 158

一、荧光显微镜暗室的要求 158

第三节 荧光显微镜的保养 158

第二节 应用举例 159

第一节 概述 159

一、流感病毒 159

第二十七章 免疫荧光法在病毒诊断上的应用 159

二、呼吸道合胞病毒 160

三、腺病毒 160

六、流行性腮腺炎病毒 161

五、风疹病毒 161

七、单纯疱疹病毒 161

四、麻疹病毒 161

九、狂犬病病毒 162

十、乙型脑炎病毒 162

八、天花病毒 162

十三、病毒性脑炎的病毒 164

十二、柯赛奇病毒 164

十四、流行性出血热病毒 164

十一、脊髓灰质炎病毒 164

一、非特异性荧光问题 165

二、非特异性荧光如何去除 165

第三节 小结 165

第二节 ELISA的种类 167

第一节 ELISA的基本原理 167

一、间接法 167

二、双抗体夹心法 167

第二十八章 ELISA技术的基本概念 167

第五篇 酶联免疫吸附试验技术 167

第二十九章 ELISA技术的方法 168

第一节 固相载体 168

八、均相酶免疫试验 168

一、主要种类 168

二、常用形式 168

三、检查方法 168

七、抑制性酶测定 168

六、免疫酶测量试验 168

五、酶抗酶法 168

四、双夹心法 168

三、竞争法 168

四、蛋白质种类 169

三、蛋白质浓度 169

五、离子强度 169

第三节 对抗原的要求 169

二、吸附时间与温度 169

一、溶液的PH 169

第二节 包被与洗涤 169

二、稀释液 170

三、稀释度 170

一、标本类型 170

第六节 酶的选择 170

一、选择条件概述 170

二、HRP的特点 170

第五节 标本处理 170

第四节 对抗体的要求 170

二、免疫活性要好 170

一、抗原纯度要高 170

第七节 交联方法 171

一、戊二醛交联法 171

二、过碘酸钠交联法 173

第九节 底物的选择 174

一、底物的种类 174

三、注意事项 174

二、底物的选择 174

三、注意事项 174

二、滴定方法 174

一、重要性 174

第八节 结合物的浓度选择 174

第十节 ELISA在人类病毒学中的应用 175

一、检测病毒抗原和抗体的ELISA方法 175

四、终点的选择 175

二、ELISA结果判读 177

三、ELISA的注意事项 178

第三十章 酶联A蛋白的酶联免疫吸附试验(PPA、ELISA)及其在病毒学中的应用 178

第一节 金葡菌蛋白A(SPA)的性质 178

一、SPA的理化性质 179

二、SPA的生物学性质 179

第二节 PPA-ELISA在病毒学中的应用 179

一、PPA-ELISA检测病毒抗体(以检测抗-HBs为例) 179

二、PPA-ELISA法检测组织培养内病毒抗原 180

第六篇 固相放射免疫测定在病毒学中的应用 181

第三十一章 病毒抗原的固相放射免疫测定法 181

第一节 试剂概述 181

一、固相 181

二、材料 181

一、直接固相放射免疫法(直接-SPRIA) 183

第二节 测定方法 183

三、检测标本 183

二、间接固相放射免疫法(间接-SPRIA) 184

三、竞争抑制放射免疫法(竞争抑制-SPRIA) 185

四、结果的表达 185

五、证实试验 185

六、对照 185

第三十二章 病毒抗体的固相放射免疫测定法 185

三、同位素标记抗体 186

二、抗人免疫球蛋白和抗种免疫球蛋白 186

一、病毒抗原 186

第一节 试剂概述 186

四、试验标本 187

第二节 测定方法 187

一、间接固相放射免疫法(间接-SPRIA) 187

二、竞争抑制固相放射免疫法(竞争抑制SPRIA) 188

三、反向放射免疫测定(反向-PSRJA) 188

四、结果的表达 189

第二节 测定方法的选择 190

第一节 病毒测定系统的地位 190

第七篇 干扰素测定方法 190

第三十三章 干扰素检测要领 190

一、测定方法的分类 191

二、标准参考制剂 191

三、病毒-细胞系统的选择 192

第三节 影响测定的主要因素 192

第三十四章 干扰素效价测定法 193

第一节 全量细胞病变抑制测定法 193

一、材料准备 193

二、操作方法 193

三、结果的观察、判定和意义 194

第二节 微量细胞病变抑制测定法 196

一、微量常规检测法 196

二、微量快速检测法 197

一、直接插入计算法 198

二、Reed-Muench计算法 198

第三节 干扰素单位计算方法 198

三、回归计算法 200

第八篇 干扰素单克隆抗体技术 202

第三十五章 单克隆抗体技术的基础知识 202

第一节 基本概念与研究简史 202

一、基本概念 202

第二节 两种亲本细胞的来源与主要特性 203

一、浆细胞瘤株的来源与主要特性 203

二、研究简史 203

二、免疫鼠脾B细胞的来源与主要特性 204

第三节 融合杂交细胞的选择原则与原理 204

一、为什么要选择 204

二、怎样选择 204

三、选择原理 204

第三十六章 单克隆抗体的基本方法与技术 207

第一节 单克隆抗体的制备全程 207

七、氨基喋呤(A)母液(×100)配法 208

八、RPMI-1640完全培基的配法 208

九、HAT培基的配法 208

六、HT母液(×100)配法 208

十、HT培基的配法 208

十一、无血清BPMI-1640的配法 208

十二、50%聚乙烯二醇(PEG)液的配法(W/V) 208

二、200mML-谷酰胺的配法 208

四、两性霉素B(25ng/ml)的配法 208

三、抗生素的配法(10，000单位/ml) 208

一、RPMI-1640培基的配法 208

第二节 有关培基与试剂配制法 208

五、5%NaHCO3的配法 208

十八、庆大霉素的配制 209

二十三、CO2孵箱观察碟中的溶液配制 209

二十二、PBS的配制(PH7.2) 209

二十一、Na-ritrate-PBS的配制(0.15MpH7.2) 209

二十、8-氮嘌鸟呤的配制 209

十九、1N NaOH的配制 209

二十四、7.5%NaHCO2的配制 209

十七、1N HC1的配制 209

十六、福氏佐剂的配法 209

十五、丙酮酸钠的配法 209

十四、10%二甲基亚砜细胞保存液的配法 209

十三、0.15MpH7.2枸橼酸钠-PBS的配法 209

一、基本概念 210

二、小鼠骨髓瘤细胞系的培养法 210

第三节 小鼠骨髓瘤细胞系的培养法及液氮保贮与复苏法 210

三、小鼠骨髓瘤细胞液氮保贮及复苏和培养法 211

二、材料准备 212

一、基本概念 212

三、操作方法 212

第四节 饲养细胞的制备方法(以小鼠腹腔巨噬细胞为例) 212

二、材料准备 213

一、基本概念 213

三、操作方法 213

第五节 免疫小鼠脾细胞的制备方法 213

四、注意事项 213

第六节 小鼠骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾细胞的融合方法 214

一、基本概念 214

四、注意事项 214

二、材料准备 216

三、操作方法 216

四、注意事项 217

第七节 融合细胞杂交瘤克隆化方法 217

一、基本概念 217

二、材料准备(以“有限稀释法”为例) 218

三、操作方法 218

四、注意事项 218

第八节 单克隆抗体的制备与纯化 219

一、单克隆抗体的大量制备 219

二、单克隆抗体的纯化 219

第九节 杂交瘤细胞及其抗体的贮存 221

一、杂交瘤细胞的保存 221

二、杂交瘤抗体的贮存 221

第三十七章 人干扰素单克隆抗体的制备方法 222

第一节 基本概念 222

第二节 Namalva干扰素单克隆抗体制备方法 223

一、材料与方法 223

二、实验结果 224

三、讨论与结论 226

四、摘要 226

第三节 人白细胞干扰素单克隆抗体制备方法 227

一、SDS-PAC纯化法 227

二、免疫BALB/C小鼠的方法 229

三、融合杂交程序 230

第三十八章 干扰素单克隆抗体的检测系统与方法 231

第一节 检测系统 231

一、检测系统的组成 231

二、检测系统的原理与应用 232

一、直接中和检测法 235

二、间接中和检测法 235

第二节 检测方法 235

三、SABA检测法 236

四、ELISA检测法 236

第二节 水解乳蛋白培基原理及配制方法 978