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第一章 抗原的制备技术 1

第一节 天然抗原的提取与纯化 1

一、抗原的提取 1

二、抗原的分离与纯化 2

三、纯化抗原的浓缩和保存 3

四、纯化抗原的鉴定 4

第二节 人工免疫原的制备 4

一、载体的类型 4

二、偶联剂与连接方法 4

第三节 合成肽抗原的制备 5

一、肽的合成与纯化 5

二、免疫原性肽的选择 6

三、载体蛋白的选择 7

四、连接方法的选择 7

五、合成肽与载体蛋白的连接 8

六、应用溴乙酰化制备环状、聚合肽及肽-载体结合物 12

第四节 基因工程抗原的制备 14

第五节 免疫刺激复合物作为佐剂的制备 14

第二章 抗体的制备技术 16

第一节 多克隆抗体的制备 16

一、免疫动物 16

二、抗血清的鉴定 17

三、抗血清的保存 18

四、抗合成肽类抗体的制备 18

第二节 杂交瘤技术制备单克隆抗体 19

一、细胞融合杂交瘤技术制备McAb的基本原理 19

二、骨髓瘤细胞的选择 20

三、小鼠B淋巴细胞杂交瘤技术 20

四、人McAb的制备 26

第三节 双特异性抗体的制备 28

第四节 抗体分子片段的制备 30

一、IgG分子片段的制备 30

二、IgM分子片段的制备 32

第五节 抗体的纯化 32

一、沉淀法 33

二、辛酸提取法 33

三、离子交换法 34

四、高效液相色谱法 36

五、亲和层析法 36

六、IgM的纯化 38

七、IgA的纯化 38

第三章 基因工程抗体技术 41

第一节 人-鼠嵌合抗体 41

二、轻、重链抗体嵌合基因共转染受体细胞 43

一、嵌合基因的构建 43

第二节 人源化抗体 44

第三节 小分子抗体 47

一、原理 48

二、构建 50

第四节 抗体库技术 51

一、抗体库技术概述 51

二、噬菌体呈示载体的构建 53

三、PCR引物的设计 54

四、抗体库的构建 56

第五节 基因工程抗体的表达、纯化及活性测定 59

一、载体的构建及抗体的表达 60

二、抗体的纯化 62

三、抗体活性及亲和力的测定 63

一、基本原理 65

第一节 抗原抗体反应的基本原理 65

第四章 抗原抗体反应 65

二、抗原抗体反应的特点 66

三、抗原抗体反应的影响因素 67

第二节 经典的抗原抗体反应 68

一、凝集反应 68

二、沉淀反应 73

三、补体结合反应 77

四、中和试验 77

第三节 免疫电泳技术 79

一、免疫电泳 79

二、对流免疫电泳 80

三、火箭免疫电泳 81

四、免疫固定电泳 82

五、交叉免疫电泳 83

二、补体结合试验 85

第四节 补体参与的抗原抗体反应 85

一、溶血试验 85

三、免疫粘附试验 88

第五节 免疫微粒技术 90

一、胶乳微粒免疫检测技术 90

二、免疫磁性微粒分离与纯化技术 92

三、微粒技术在分子生物学研究中的应用 92

第五章 免疫标记技术 94

第一节 免疫荧光技术 94

一、经典的免疫荧光技术 94

二、现代免疫荧光分析技术 99

第二节 放射免疫技术 104

一、放射免疫测定 104

二、免疫放射测定 108

三、放射受体分析 111

第三节 免疫酶技术 112

一、酶标抗体的制备与质量鉴定 112

二、非均相(或异相)酶免疫测定 116

三、均相酶免疫测定 123

第四节 免疫电镜技术 126

一、免疫电镜技术常用标记物及其制备方法 126

二、免疫电镜技术的不标记抗体法 129

第五节 胶体金标记技术 131

一、基本原理 131

二、胶体金的制备 131

三、胶体金标记蛋白的制备 133

四、胶体金标记技术在免疫学试验中的应用 135

第六节 生物素与亲合素标记技术 137

一、生物素与亲合素的生物学特性 137

二、生物素标记技术 138

三、亲合素标记技术 140

四、生物素-亲合素系统的试验方法和原理 141

五、生物素-亲合素系统的实验应用 142

第七节 化学-生物发光及发光免疫分析 145

一、化学发光与生物发光 145

二、发光标记物和发光标记技术 149

三、发光免疫分析技术 154

第六章 免疫组织化学技术 162

第一节 免疫荧光细胞化学技术 162

一、免疫荧光染色方法 162

二、对照染色的设立 164

三、非特异性荧光及其消除方法 164

四、免疫荧光染色中的几个问题 165

第二节 免疫酶细胞化学技术 165

一、酶标记抗体免疫组化染色法 165

二、非标记抗体免疫酶组化染色法 166

三、免疫酶组化技术中常用的酶显色底物 168

第三节 亲合组织化学技术 169

一、生物素-亲合素技术 169

二、葡萄球菌A蛋白的应用 170

三、凝集素 170

四、链霉亲合素-生物素技术 171

第四节 免疫金银及铁标记免疫组化技术 172

一、免疫金染色法 172

二、免疫金银染色法 172

三、彩色免疫金银法 173

四、免疫胶体铁细胞化学技术 173

第七章 流式细胞术(FCM)在生物医学中的应用 175

第一节 流式细胞术发展简史 175

一、流式细胞术仪器的发展 175

一、概述 176

二、流式细胞术的工作原理 176

二、流式细胞术方法学的发展 176

第二节 流式细胞术的工作原理 176

三、流式细胞术的技术特点 178

四、流式细胞术可检测的细胞参数 178

五、影响流式细胞术定量分析的因素 179

第三节 流式细胞术的荧光染色、检测和分析 179

一、概述 179

二、流式细胞术的荧光染色 180

三、样品的流式细胞术检测和分析 183

四、流式免疫荧光技术的应用 186

五、几种流式免疫荧光技术的具体方法 187

第四节 流式细胞分选术 191

一 、分选方式 191

一、细胞膜电位的测定 193

二、激光流式分选条件的选择 193

第五节 流式细胞术对细胞膜定位、细胞内钙离子和pH值的测定 193

二、细胞内钙离子的流式细胞术测定 194

三、FCM测定细胞内pH值 194

第六节 流式细胞术对细胞DNA的测定 195

一、流式细胞术DNA检测的组织来源 195

二、常用于流式细胞术DNA检测的荧光染料 195

三、流式DNA定量分析的染色原理 196

四、定量分析DNA的染色方法 197

五、细胞DNA检测的内参考标准 198

六、定量荧光细胞染色技术的评价标准 198

七、DNA直方图引伸的主要参数 199

第八章 免疫球蛋白及其他免疫相关蛋白的测定 201

第一节 免疫球蛋白测定 201

一、IgG、IgA、IgM的测定 201

三、IgE的测定 206

二、IgD的测定 206

四、异常免疫球蛋白的测定 208

第二节 常见自身抗体的检测原则与方法 210

一、抗甲状腺球蛋白抗体的检测 211

二、抗甲状腺过氧化物酶抗体检测 212

三、抗心磷脂抗体检测 212

四、抗肝特异性脂蛋白抗体检测 213

五、抗平滑肌抗体检测 214

六、抗线粒体抗体检测 214

七、类风湿因子测定 215

八、抗核抗体检测 216

九、抗双链DNA抗体检测 216

十、ENA多肽抗体谱检测 217

十一、抗中性粒细胞胞浆抗体测定 218

十二、抗组蛋白抗体测定 219

十四、抗子宫内膜抗体检测 220

十三、抗精子抗体检测 220

十五、抗卵巢抗体检测 221

十六、抗透明带抗体检测 221

十七、抗乙酰胆碱受体抗体检测 222

十八、特异性神经元抗核抗体检测 223

第三节 血清中其他免疫相关蛋白的测定 224

一、急性反应期蛋白测定 224

二、β2-微球蛋白测定 225

三、肌红蛋白测定 226

四、纤维连接蛋白测定 227

五、α2巨球蛋白测定 228

六、甲状腺球蛋白测定 229

七、溶菌酶测定 230

一、血清补体总活性的测定 232

第九章 补体测定技术 232

第一节 补体总活性的测定 232

二、补体旁路途径溶血活性的测定 233

第二节 补体各成分的测定 234

一、溶血法 235

二、免疫化学法 236

第三节 补体裂解产物的测定 237

一、C3裂解产物的检测 237

二、C5裂解产物的检测 239

三、ELISA检测补体终末复合物SCb-9或MC5b-9 240

第四节 补体遗传多态性的检测 241

一、补体C4遗传多态性的检测 241

二、补体C2遗传多态性的检测 243

三、补体B因子(Bf)遗传多态性的检测 244

第一节 循环免疫复合物的测定 246

第十章 免疫复合物的测定 246

一、聚乙二醇(PEG)沉淀试验 247

二、PEG沉淀补体消耗试验 248

三、抗补体试验 249

四、SPA夹心ELISA试验 250

五、细胞受体结合免疫测定法 251

第二节 特异性循环免疫复合物的测定 252

一、胰蛋白酶解离法检测HBsAg-CIC 252

二、捕获法ELISA检测肾综合征出血热Ag/IgE和Ag/IgD-CIC 253

三、捕获法ELISA检测HBsAg/C3-CIC 253

四、捕获法ELISA检测甲型肝炎Ig/C3-CIC 253

第三节 局部免疫复合物的测定 254

第十一章 细胞因子及其受体的检测 255

第一节 细胞因子受体的测定 255

二、IL-2R的检测 256

一、细胞因子受体检测的基本技术 256

第二节 可溶性及膜结合型白介素的测定 258

一、IL-1的检测 258

二、IL-2的诱生与测定 261

三、IL-3的检测 263

四、IL-4的检测 265

五、IL-5的检测 267

六、IL-6的检测 268

七、IL-7的检测 269

八、IL-8的检测 270

九、IL-9的测定 271

十、IL-10的测定 271

十一、IL-11的测定 272

十二、IL-12的测定 273

十三、白介素其他成员的检测 274

一、IFN-α和IFN-β的诱生和测定 275

第三节 干扰素的测定 275

二、IFN-γ的诱生和测定 277

第四节 干细胞因子的检测 278

一、UT-7细胞增殖法 278

二、MC/9细胞增殖法 278

三、放射受体测定 278

第五节 转化生长因子-β的测定 279

一、胸腺细胞增殖法 279

二、放射受体测定法 280

第六节 集落刺激因子的测定 280

一、CSF的诱生 280

二、CSF的检测 281

第七节 肿瘤坏死因子测定 281

一、生物学活性检测法 281

二、TNF的免疫学检测法 283

三、TNF的类型检测 284

第八节 细胞因子基因的测定 284

一、细胞因子的DNA检测 284

二、细胞因子mRNA表达的测定 285

第十二章 免疫细胞的分离与功能检测 288

第一节 外周血单个核细胞的分离与纯化 288

一、外周血单个核细胞的分离 288

二、淋巴细胞的纯化 290

第二节 外周血淋巴细胞的选择性分离 291

一、T细胞的分离 291

二、T细胞亚群的分离 293

三、B细胞的分离 295

四、NK细胞及LAK前体细胞的分离 296

第三节 淋巴细胞亚群的检测 296

一、免疫荧光技术 296

二、微量细胞毒试验 297

三、花环技术 298

四、免疫酶染色技术 299

第四节 淋巴细胞功能测定 300

一、淋巴细胞增殖反应试验 301

二、淋巴细胞多克隆抗体产生的测定 303

三、特异性抗原刺激人体内、外抗体产生的测定 306

四、多克隆及抗原特异性细胞毒性T细胞功能的测定 306

五、LAK/TIL细胞的制备与活性测定 307

六、NK细胞活性测定 309

第五节 中性粒细胞的分离与功能测定 312

一、中性粒细胞的分离方法 312

二、中性粒细胞的功能测定 313

第六节 单核-巨噬细胞的分离与功能测定 315

一、人单核细胞的分离方法 315

二、单核-巨噬细胞的功能测定 316

一、嗜碱性粒细胞的分离方法 319

第七节 嗜碱性粒细胞的分离与功能测定 319

二、嗜碱性粒细胞的功能测定--嗜碱性粒细胞颗粒试验 320

第八节 组织肥大细胞的分离 321

第九节 粘附分子的测定 321

一、可溶性粘附分子的测定 321

二、细胞膜上粘附分子的测定 322

第十节 红细胞免疫功能的测定 323

一、红细胞C3b受体花环及免疫复合物花环试验 323

二、红细胞的SPA-酵母菌混合花环试验 324

三、单克隆抗体Coombs试验 324

四、血清中红细胞免疫调节因子活性的测定 325

五、红细胞增强白细胞吞噬功能的简易形态学方法 325

六、红细胞对肿瘤细胞免疫粘附能力的测定方法 326

七、红细胞促淋巴细胞与中性粒细胞对肿瘤细胞免疫粘附能力的测定 326

一、鼠脾、胸腺和淋巴结单个核细胞的分离 328

第十三章 实验动物免疫细胞功能的测定 328

第一节 鼠单个核细胞的分离纯化 328

二、T细胞和B细胞的分离纯化 329

三、树突状细胞的分离 330

第二节 鼠T细胞功能的测定 331

一、鼠T细胞增殖试验 331

二、细胞毒性T细胞活性的诱导及测定 332

三、T细胞功能的定量测定(有限稀释法) 335

四、胚胎胸腺细胞培养与T细胞分化发育 336

五、小鼠体内T细胞功能测定 338

第三节 鼠B细胞功能的测定 339

一、小鼠B细胞增殖试验 339

二、体内、外抗体合成的测定 340

二、细胞凋亡与细胞坏死的区别 342

一、细胞凋亡的基本概念 342

第一节 细胞凋亡的概念 342

第十四章 细胞凋亡及其检测方法 342

三、研究细胞凋亡的意义 343

第二节 细胞凋亡的检测方法 344

一、形态学方法 344

二、生物化学方法 345

三、免疫学方法 346

四、原位末端转移酶标记技术 347

五、靶细胞DNA片段的定量分析与杀伤细胞介导的细胞溶解试验 348

六、流式细胞分析术 349

第十五章 免疫细胞内信息传递的检测 353

第一节 免疫细胞磷脂酰肌醇转换的分析 353

一、用Dowex阴离子交换层析分离［3H］-磷酸肌醇 353

二、HPLC分离磷酸肌醇 354

三、薄层层析(TLC)分离肌醇磷脂 355

第二节 细胞内Ca2+浓度的测定 356

第三节 蛋白激酶C的活性测定 357

第四节 细胞内环核苷酸浓度的测定 358

第五节 磷酸化蛋白的研究分析 359

一、正磷酸盐标记细胞 360

二、磷酸化氨基酸分析 361

第六节 抗磷酸化酪氨酸印迹技术 362

一、用AP显色系统检测 362

二、125I-标记的SPA检测法 363

第十六章 细胞培养技术 365

第一节 实验室一般条件和工作规则 365

一、实验室的一般条件 365

二、实验室的一般工作规则 368

第二节 细胞培养的基本条件 368

第三节 原代细胞培养 369

第四节 传代细胞培养 370

第五节 HTLV-转化细胞培养 371

一、HTLV-1型或2型转化人T细胞的方法 372

二、注意事项 372

第六节 EBV转化细胞的培养 373

一、EBV的制备 373

二、靶细胞的制备 373

三、EBV转化靶细胞 373

第七节 T细胞克隆技术 374

一、抗原特异性T细胞克隆的制备 374

二、抗原非特异性T细胞克隆的制备 374

三、鼠T细胞克隆的制备 375

第八节 T细胞杂交瘤技术 376

一、淋巴瘤细胞系的选择 376

第九节 控制和清除细胞培养中的污染 377

四、T细胞杂交瘤的筛选 377

三、饲养细胞的选择与制备 377

二、特异性T细胞的制备与活化 377

一、抗菌素的应用 378

二、细菌和真菌污染的处理 378

三、培养细胞污染支原体的检测和处理 378

第十七章 HLA分型技术 381

第一节 血清学分型技术 381

一、淋巴细胞分离法 381

二、HLA-A、B、C、DR、DQ抗原分型法 382

第二节 细胞学分型技术 383

一、HLA-D抗原的测定 383

二、HLA-DP抗原的测定 383

第三节 DNA分型技术 384

一、PCR-SSP 384

三、PCR-SSCP 386

二、PCR-RFLP 386

四、PCR-SSO 387

第十八章 蛋白质的分离和分析技术 389

第一节 淋巴细胞膜蛋白的制备 389

一、非离子型去污剂提取淋巴细胞膜蛋白 390

二、匀浆器制备膜蛋白 391

第二节 应用抗体分离蛋白质 392

一、免疫亲和层析 392

二、免疫沉淀法 394

第三节 蛋白质的电泳分离 397

一、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离的基本原理和重要参数 397

二、蛋白质的单向凝胶电泳 398

三、双向凝胶电泳系统 402

四、对角凝胶电泳(Diagonal凝胶电泳) 404

五、用于微序列分析的蛋白质分离方法 404

六、染色凝胶中蛋白质的分离纯化 406

一、凝胶蛋白染色 408

第四节 蛋白质的测定 408

二、免疫印迹法 410

三、可溶性或膜结合型蛋白质的碘标记 412

四、蛋白质的生物合成标记技术 413

第十九章 免疫学中常用的基因克隆与表达技术 417

第一节 RAN的制备和分析 417

一、RNA的提取 417

二、RNA的Northern杂交分析 421

第二节 DNA的分离与纯化 423

一、从液相中分离、纯化、浓缩DNA 423

二、哺乳动物细胞基因组DNA的制备 424

三、细菌质粒DNA的制备 425

第三节 DNA片段的分离与回收 426

一、尼龙膜Southern杂交(同位素标记) 430

第四节 基因组DNA的分析 430

二、地高辛(非同位素)标记 432

第五节 DNA的限制性内切酶酶切、连接与转化 433

一、DNA的限制性内切酶酶切 433

二、DNA分子的体外连接 434

三、重组质粒的转化 434

四、质粒DNA阳性克隆的筛选 435

第六节 DNA序列测定 435

一、测序反应原理 436

二、体外扩增DNA的直接测序(PCR测序技术) 436

三、同位素标记法测序 439

四、银染色法测序 440

五、荧光标记法测序 442

第七节 克隆DNA的转染和表达 443

一、磷酸钙共转染法 444

二、DEAE-葡聚糖转染法 446

三、电穿孔转染 448

四、脂质体介导的转染 449

五、哺乳动物细胞的稳定基因转染 450

六、克隆基因的表达 451

第二十章 原位分子杂交技术 454

第一节 概述 454

一、核酸分子杂交的基本原理 454

二、基本方法 455

三、探针的种类 456

第二节 探针的标记技术 456

一、同位素标记 456

二、生物素标记 457

三、地高辛标记 457

四、荧光素标记 458

五、联合标记 459

六、常用的探针标记技术 459

第三节 原位杂交组化技术 462

一、组织切片与培养细胞原位杂交技术 462

二、PCR与原位杂交技术 464

三、电镜水平的原位杂交技术 465

四、原位杂交与免疫细胞化学结合法 467

第二十一章 免疫学中常用的PCR技术 471

第一节 PCR技术原理 471

第二节 PCR反应体系的组成及其条件的优化 472

一、模板核酸 472

二、寡聚核苷酸引物 472

五、Mg2+的浓度 473

六、耐热DNA聚合酶 473

四、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP) 473

三、PCR反应缓冲液 473

七、循环参数 474

八、防止污染的对策 474

九、PCR常见问题及处理 475

十、扩增的忠实性 475

第三节 PCR分类 475

一、典型PCR，以DNA为模板 475

二、逆转录PCR(RT-PCR) 476

三、免疫PCR(IM-PCR) 476

第四节 不同来源标本DNA的PCR扩增 477

一、PCR扩增模板DNA的制备 477

二、以DNA为模板的PCR扩增 477

第五节 定量PCR 478

一、内参照定量PCR 478

二、竞争PCR作mRNA定量 479

第六节 免疫PCR(IM-PCR) 481

一、DNA的生物素标记 481

二、免疫PCR操作步骤 481

三、注意事项 482

第七节 PCR在淋巴细胞抗原受体研究中的应用 483

一、 应用PCR扩增T细胞受体基因重排 483

二、用PCR检测白血病时T细胞受体β链基因重排 484

三、应用锚定PCR技术对T细胞受体δ链进行分析 484

四、PCR扩增免疫球蛋白重链的CDR3基因 486

中英对照专业词汇 500

附录 500

一、核酸、蛋白质常用数据及其换算 500

二、常用缓冲液和贮存液的配制 502

三、常用酸碱的技术参数 504

四、细胞染色技术 505

五、免疫学研究中常用的鼠系 507