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第1章 冰冻显微免疫细胞化学的发展和应用 1

1.1 历史简述和技术发展 1

1.2 标记方法的选择 3

1.3 显微免疫细胞化学在分子生物学和医学研究的应用 7

1.3.1 在细胞分子生物学中的应用 7

1.3.2 在病理学和肿瘤诊断中的应用 9

第2章 冰冻切片和光学显微镜的免疫细胞化学 12

2.1 免疫标记的基本原理 12

2.1.1 抗体的种类 12

2.1.2 抗体的结构 13

2.1.3 抗原定位标记物 13

2.1.4 抗体的标记方式 17

2.1.5 抗体对不同抗原的双重或多重标记 20

2.2 抗体特异性测定和实验对照 20

2.2.1 测定新的第一抗体 20

2.2.2 抗体所引起的非特异性染色 21

2.2.3 防止非特异性标记的方法 21

2.3 生物样品的处理和冰冻切片 22

2.3.1 大组织块的冰冻切片方法 22

2.3.2 冰冻半薄切片方法 25

2.4 免疫荧光标记 30

2.4.1 抗体和标记方法的选择 30

2.4.2 荧光染料的特性和选择 31

2.4.3 双重或多重荧光标记 33

2.4.4 标记的步骤 33

2.5 免疫过氧化物酶显色标记 34

2.5.1 抗生物素蛋白-生物素方法 35

2.5.2 快速临床免疫组织化学染色方法 38

2.6 免疫标记出现问题的处理 39

2.7 免疫标记实例 42

2.7.1 老鼠胆管纤毛的冰冻半薄切片荧光标记 42

2.7.2 用荧光和冰冻超薄切片对人胎盘抗原定位 43

2.7.3 快速免疫组织化学染色 44

第3章 冰冻超薄切片和电子显微镜的免疫金标记 46

3.1 引言 46

3.2 设备和试剂的准备 47

3.2.1 冰冻切片机 47

3.2.2 切片刀 47

3.2.3 支持膜制作和碳覆盖 48

3.2.4 免疫金粒标记物的制备 49

3.3 生物样品的固定和处理方法 54

3.3.1 固定剂 54

3.3.2 其他影响固定质量的条件 55

3.3.3 固定程序 56

3.3.4 样品包埋处理 58

3.3.5 蔗糖冰冻保护 59

3.3.6 样品的安放和冰冻 59

3.4 冰冻超薄切片 60

3.4.1 样品的初修整和半薄切片 60

3.4.2 样品块的细修整 61

3.4.3 冰冻超薄切片 61

3.4.4 切片的收集 62

3.4.5 冰冻切片的保存 62

3.5 免疫标记 63

3.5.1 标记方法和程序 63

3.5.2 蛋白A法 64

3.5.3 IgG法 67

3.6 图像的分析和问题处理 67

3.7 应用实例 71

3.7.1 蛋白A标记的应用例子 71

3.7.2 IgG方法的应用例子 71

第4章 快速冰冻固定方法 72

4.1 引言 72

4.2 冰冻固定的原理 73

4.3 冰冻保护剂 76

4.3.1 渗透性冰冻保护剂 77

4.3.2 非渗透性冰冻保护剂 77

4.4 冰冻固定的主要方法 78

4.4.1 插入式冰冻方法 79

4.4.2 冷金属块撞击式冰冻固定 85

4.4.3 丙烷喷射冰冻固定 89

4.4.4 喷洒式冰冻固定 92

4.4.5 高压冰冻固定 95

第5章 高压冰冻固定 98

5.1 高压冰冻固定的基本原理 98

5.2 样品处理和装放的关键步骤 100

5.2.1 样品载体 100

5.2.2 载体内细胞和组织的填充剂 103

5.2.3 冰冻保护剂 104

5.2.4 样品的装放 104

5.3 冰冻样品的处理 109

5.4 常规化学固定和高压冰冻固定效果的比较 111

5.4.1 化学固定和高压冰冻固定的比较 111

5.4.2 高压冰冻固定的局限性 113

5.5 冰冻固定过程中出现的问题和解决方法 114

5.5.1 高压冰冻固定的注意事项 114

5.5.2 冰冻固定过程中出现的问题和解决方法 114

第6章 冰冻置换 116

6.1 概述 116

6.2 冰冻置换的条件 118

6.2.1 冰冻置换的温度和材料的准备 118

6.2.2 冰冻置换的有机溶剂的选择和评估 119

6.2.3 冰冻置换装置 120

6.3 冰冻置换方法 121

6.3.1 加入固定剂的冰冻置换 121

6.3.2 免疫标记的冰冻置换 123

6.3.3 冰冻置换的各种使用方法 124

第7章 低温包埋和免疫标记 129

7.1 渐进低温脱水和丙烯树脂包埋 129

7.1.1 温度调整的方法和脱水溶剂 129

7.1.2 丙烯树脂的特点和Lowicryl的配方 130

7.1.3 渐进低温脱水方法 131

7.1.4 低温渗透 132

7.1.5 低温包埋 134

7.1.6 树脂聚合 134

7.1.7 Lowicryl树脂包埋块的切片 136

7.2 LR White和LR Gold树脂包埋 137

7.2.1 LR White树脂的准备和包埋 137

7.2.2 LR Gold树脂的包埋 139

7.3 免疫标记 141

7.3.1 免疫标记的准备和应注意的问题 141

7.3.2 丙烯酸树脂切片的免疫标记步骤 141

7.3.3 后包埋免疫标记法 142

7.4 免疫标记信号增强法 144

7.4.1 纳米金-银染信号增强法 144

7.4.2 胶体金／抗生物素法 145

7.4.3 生物素-抗生物素金技术 147

7.4.4 生物素化酪胺和纳米金银染法 148

7.5 免疫标记中可能遇到的问题和处理方法 149

7.6 应用实例 151

7.6.1 动物单层细胞的后包埋免疫标记 151

7.6.2 植物细胞的低温包埋和免疫标记 152

7.6.3 大鼠胰腺和肝组织的免疫电镜标记——生物素-酪胺增强法 153

第8章 前包埋免疫电镜技术 156

8.1 细胞和组织标记前的处理 156

8.2 抗体标记 157

8.3 前包埋免疫标记应用实例 160

8.3.1 过氧化物酶标记单层培养细胞抗原 160

8.3.2 纳米金前包埋免疫电镜 161

8.3.3 前包埋纳米金-银染和酪胺扩增法 162

8.4 前包埋免疫双标记 163

第9章 荧光显微镜和免疫电镜的对应定位技术 166

9.1 概述 166

9.2 突变细胞荧光活体和超微结构对应定位技术 167

9.2.1 活体突变细胞定位 168

9.2.2 电镜样品的处理和细胞定位 169

9.3 荧光纳米金在荧光和免疫金标记的对应定位 171

9.3.1 荧光纳米金探针的结构和特性 172

9.3.2 荧光纳米金标记方法 173

9.4 冰冻超薄切片的对应免疫荧光光镜和电镜 174

9.5 量子点的光电镜对应定位 177

9.5.1 量子点作为免疫细胞学标记物的主要特点 177

9.5.2 量子点标记应用实例 178

9.6 荧光蛋白的对应光电镜定位 179

9.6.1 细胞荧光蛋白表达的光电镜对应标记方法 180

9.6.2 绿荧光蛋白光氧化的对应荧光和电镜方法 183

第10章 冰冻断裂复型的免疫电镜 185

10.1 概述 185

10.2 冰冻断裂和刻蚀 189

10.2.1 样品的准备 189

10.2.2 冰冻保护——甘油渗透方法 192

10.2.3 冷冻处理 192

10.2.4 冰冻断裂 193

10.2.5 冰冻刻蚀 194

10.2.6 复型 195

10.2.7 复型膜的收集和清理 196

10.3 复型膜面的免疫标记 197

10.3.1 常规的标记步骤 197

10.3.2 冰冻、断裂和复型前标记 197

10.3.3 冰冻断裂后标记 200

10.3.4 断裂和复型后的标记 202

10.3.5 复型-标记-切片和复型-标记-整体装放 204

10.4 应用实例 206

10.4.1 用SDS消化冰冻断裂复型和细胞化学标记膜间蛋白——免疫金标记胞间连接复合物 206

10.4.2 用SDS消化冰冻断裂复型标记螺旋菌壁黏附素的新方法 208

第11章 负染色和免疫金标记技术 209

11.1 概述 209

11.2 负染色技术 211

11.2.1 负染色的材料和准备 211

11.2.2 负染色方法 213

11.3 负染色免疫电镜方法 214

11.3.1 负染色免疫电镜常规步骤 214

11.3.2 负染色免疫电镜应用实例 216

11.4 冰冻负染色方法 217

11.4.1 材料准备 217

11.4.2 非染色冰冻样品的制作步骤 220

11.4.3 薄膜玻璃化负染色样品的制作 221

11.5 负染色需要注意的问题 223

附录Ⅰ 225

附录Ⅱ 部分冰冻固定、免疫标记和抗体制作技术网址 228

参考文献 230