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第一章 脱氧核糖核酸（DNA） 1

第一节 DNA的提取 1

一、质粒DNA的提取 1

（一）细菌质粒DNA的小量制备 1

（二）细菌质粒DNA的大量制备 7

（三）酵母质粒DNA的分离 11

二、基因组DNA的提取 14

（一）细菌基因组DNA的制备 14

（二）哺乳动物细胞基因组DNA的提取 15

（三）真核生物DNA分离的一般方法 17

（四）从植物中分离基因组DNA 18

（五）用CTAB提取植物DNA 19

第二节 电泳 20

一、琼脂糖凝胶电泳 20

二、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 22

三、脉冲场凝胶电泳（PFGE） 24

四、变性梯度凝胶电泳（DGGE） 26

五、双向琼脂糖凝胶电泳 28

六、碱性琼脂糖凝胶电泳 31

七、从琼脂糖凝胶中纯化DNA的方法 32

（一）反复冻融法 32

（二）利用玻璃奶法从琼脂糖凝胶上分离 DNA片段 32

（三）低熔点琼脂糖纯化法 34

第三节 DNA定量分析 35

第四节 DNA的酶学操作 39

一、DNA限制性内切酶酶切反应 39

二、同一反应体系内的DNA双酶切反应 40

三、DNA的连接反应 41

四、DNA聚合酶和聚合反应 42

五、用外切核酸酶Ⅲ产生单向缺失 44

六、用磷酸酶使DNA脱磷酸化 45

七、用多核苷酸激酶使DNA磷酸化 46

八、利用RNA酶处理法制备不含RNA的DNA 47

九、用32P或生物素标记DNA探针 47

第五节 聚合酶链式反应（PCR） 49

一、PCR技术简介 49

（一）PCR技术的原理 49

（二）影响PCR反应的因素及条件选择 50

（三）设计引物应遵循的原则 51

二、通过PCR方法扩增一个已知基因 51

第六节 DNA克隆 53

一、PCR产物的TA克隆 53

二、基因组DNA文库的构建 55

三、DNA文库的筛选 59

四、应用PCR技术快速筛选克隆 61

第七节 DNA转化与转染 62

一、质粒DNA转化入细菌 62

（一）CaC12法感受态大肠杆菌的制备与转化 62

（二）利用TSS缓冲液转化大肠杆菌 63

（三）用快速冷冻法转化大肠杆菌 64

（四）假单孢细菌的转化 65

（五）细菌的电击穿孔转化 66

二、酵母DNA转化 69

（一）原生质体法 69

（二）醋酸锂法 70

（三）电击穿孔法 71

三、农杆菌介导的植物细胞转化 73

（一）电穿孔法转染根癌农杆菌 73

（二）三亲杂交法转染农杆菌 75

（三）烟草叶圆盘与农杆菌共培养获得抗生素抗性小植株 77

四、哺乳动物细胞的DNA转染 80

（一）磷酸钙法转染哺乳动物细胞 80

（二）DEAE-Dextran法转染哺乳动物细胞 81

（三）阳离子脂质体介导的转染法转染真核细胞 83

（四）辅助方案：转染的甘油处理 84

（五）辅助方案：用Hirt氏提取法抽提染色体外游离DNA 84

（六）电击穿孔转染技术 85

五、反转录病毒介导的基因转移 86

第八节 DNA检测与图谱分析 89

一、同位素标记Southern杂交 89

二、荧光染料标记Southern杂交法 93

三、DNA限制性片段长度多态性（RFLP）分析 96

第九节 基因表达与调控 98

一、在大肠杆菌中表达重组蛋白 98

二、酵母表达系统 101

三、几种新型原核基因融合表达载体 107

四、利用杆状病毒在昆虫细胞中进行蛋白表达 113

五、外源DNA在蟾蜍卵及胚中的表达 118

六、VTF7-3株重组痘苗病毒在哺乳动物细胞中的瞬时表达 122

七、反义技术 123

第二章 核糖核酸（RNA） 130

第一节 创造无RNA酶的环境和凝胶电泳 130

一、创造无RNA酶的环境 130

二、RNA凝胶电泳 131

第二节 RNA的分离 133

一、RNA的酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步分离法 133

二、使用Trizol Reagent一步法分离RNA 135

三、从大肠杆菌中分离RNA 136

四、用CsCl超速离心法从动物组织中分离RNA 137

五、用Oligo（dT）-纤维素分离Poly（A）＋RNA 138

六、从RNA表达载体中制备RNA转录物 139

第三节 RNA的检测 141

一、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR） 141

二、竞争性RT-PCR 143

三、一步RT-PCR 145

四、mRNA的差异显示 147

五、原位PCR和杂交——低丰度核酸的检测 152

第四节 RNA的杂交检测 155

一、Northern杂交 155

二、一种快速Northern杂交方法 157

三、原位杂交 158

第五节 cDNA文库的构建与筛选 163

第三章 蛋白质 172

第一节 蛋白质的提取与分离 172

一、条件培养基的制备 172

二、膜蛋白的提取 173

三、用于蛋白质检测的细胞裂解物的制备 174

第二节 蛋白质电泳 175

一、聚丙烯酰胺凝胶电泳 175

二、变性凝胶电泳（SDS-PAGE） 178

三、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 181

四、琼脂糖凝胶免疫电泳法测定胎儿甲种球蛋白 184

五、双向聚丙烯酰胺凝胶电泳 186

六、凝胶中蛋白质的染色鉴定 188

（一）考马斯亮蓝染色法 188

（二）银染法 189

（三）转印膜上蛋白质的染色 191

七、凝胶的干燥 192

（一）热真空干燥法 192

（二）甘油玻璃纸干燥法 192

第三节 蛋白质的鉴定和定量测定 193

一、酶联免疫吸附法（ELISA） 193

二、免疫沉淀法 204

三、蛋白质印迹法 205

四、增强化学发光蛋白免疫印迹法 207

五、蛋白质配基印迹法 208

六、配基和蛋白质间的亲合交联试验法 210

第四章 生物芯片技术 212

第一节 生物芯片技术原理 212

第二节 基因芯片实验流程 212

一、芯片微矩阵制备 214

二、探针制备及标记 217

三、杂交及后处理 219

四、检测分析结果 219

第三节 蛋白质芯片实验流程 222

第五章 计算机技术在分子生物学中的应用 224

一、计算机程序在分子生物学中的应用 224

二、计算机网络在分子生物学研究中的应用 226

（一）文献检索 226

（二）分子生物学数据库 227

（三）中英文在线生物资源 230

（四）网上分子生物学相关杂志 233

第六章 分子生物学实验常用参数及资料 236

一、分子生物学实验中的常用数据及换算关系 236

（一）氨基酸的主要参数 236

（二）核苷和脱氧核苷三磷酸的物化常数 237

（三）常用单位及换算方法 237

（四）常用核酸、蛋白质换算数据 237

（五）氨基酸与对应的遗传密码子 238

（六）常用DNA分子量参照物 238

（七）常用核酸的长度（kb）与其相对分子量的关系 239

二、分子生物学实验中的常用试剂及溶液、缓冲液 240

（一）常见市售酸碱的浓度 240

（二）各种浓度酸碱贮存液的近似pH值 240

（三）有机试剂的配制 241

（四）细菌培养基和抗生素 241

（五）常用缓冲液的配制 244

（六）杂交试验中用于降低背景的封闭剂 247

（七）常见限制性内切酶酶切位点及缓冲液 248

三、与分子生物学实验相关的实验资料 249

（一）同位素资料 249

（二）与DNA凝胶电泳有关的数据 250

（三）离心机转子速度和相对离心力列线圈 251

（四）X光底片的冲洗方法 252

（五）溴化乙锭溶液的净化处理 253

（六）细菌保存 254

四、常用仪器使用方法 255

（一）恒温箱 255

（二）电热恒温水浴 256

（三）电动离心机 256

（四）722型光栅分光光度计 256

（五）751G型分光光度计 257

（六）自动部分收集器 258

（七）核酸蛋白检测仪 259

（八）电子顶载天平 260

（九）电子分析天平 260

（十）pHS-3C型数字酸度计 261

（十一）pHS-2型酸度计 261

（十二）移液器的使用 262

五、常用实验用品的处理 263

（一）玻璃器皿的处理 263

（二）硫酸清洁液的配制方法与注意事项 263

（三）透析袋的处理 263

（四）玻璃器皿的硅化 264

六、名词解释 264

参考文献 268