重组DNA的原理和方法PDF电子书下载

常用名词缩写 1

第1章 分子克隆的工具酶 1

1.1 限制酶 1

1.1.1 限制酶的发现和命名 1

1.1.2 Ⅰ型和Ⅲ型限制酶 2

1.1.3 Ⅰ型限制酶 2

1.1.4 DNA甲基化 6

1.1.4.1 用常用的E.coli菌株进行甲基化 6

1.1.4.2 用甲基化酶进行甲基化 8

1.1.4.3 甲基化对DNA图谱分析的影响 16

1.1.5 限制酶酶切反应 17

1.1.5.1 酶切反应注意事项 17

1.1.5.2 酶切反应 21

1.1.5.3 酶切反应中常见问题 22

1.1.5.4 酶切产物的连接 24

1.2 分子克隆中的其他酶 25

1.2.1 酶的用途及反应条件 25

1.2.2.1 T4 DNA连接酶 28

1.2.2 连接酶 28

1.2.2.2 E.coli DNA连接酶 29

1.2.2.3 T4 RNA连接酶 29

1.2.3 聚合酶 29

1.2.3.1 DNA聚合酶Ⅰ 30

1.2.3.2 Klenow片段 31

1.2.3.3 T4 DNA聚合酶 32

1.2.3.5 修饰的T7 DNA聚合酶 33

1.2.3.6 Taq DNA聚合酶 33

1.2.3.4 T7 DNA聚合酶 33

1.2.3.7 DNA末端转移酶 34

1.2.3.8 反转录酶 34

1.2.3.9 E.coli RNA聚合酶 36

1.2.3.10 噬菌体SP6.T7和T3RNA聚合酶 36

1.2.3.11 多聚(A)聚合酶 37

1.2.3.12 鸟苷酸转移酶 37

1.2.4 核酸酶 37

1.2.4.1 绿豆核酸酶 37

1.2.4.2 核酸酶S? 37

1.2.4.4 DNA酶Ⅰ 38

1.2.4.3 核酸外切酶Ⅲ 38

1.2.4.6 λ噬菌体核酸外切酶 39

1.2.4.5 核酸酶BAL31 39

1.2.4.7 λ末端酶 40

1.2.4.8 尿嘧啶N-糖基酶 40

1.2.4.9 RNA酶H 40

1.2.4.10 RNA酶A 40

1.2.5 激酶和磷酸酶 41

1.2.5.1 T4多核苷酸激酶 41

1.2.4.11 RNA酶T1 41

1.2.5.2 碱性磷酸酶 42

1.2.5.3 氯霉素乙酰转移酶 42

1.2.6 DNA结合蛋白 42

1.2.6.1 单链DNA结合蛋白(SSB) 42

1.2.6.2 RecA蛋白 43

1.2.6.3 拓扑异构酶Ⅰ 43

2.1.3 电泳环境 44

2.1.1 样品 44

2.1.2 电场 44

第2章 凝胶电泳 44

2.1 影响凝胶电泳迁移率的因素 44

2.2 凝胶电泳的类型 45

2.2.1 琼脂糖凝胶电泳 45

2.2.1.1 琼脂糖凝胶性质 45

2.2.1.2 电泳装置 45

2.2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳 46

2.2.2.1 聚丙烯酰胺凝胶的性质 46

2.2.1.4 凝胶浓度的选择 46

2.2.1.3 电泳缓冲液 46

2.2.2.2 电泳装置 47

2.2.2.3 凝胶浓度的选择 47

2.3 DNA琼脂糖凝胶电泳 48

2.3.1 常规琼脂糖凝胶电泳 48

2.3.2 微型琼脂糖凝胶电泳 49

2.3.3 碱性琼脂糖凝胶电泳 50

2.3.4 脉冲凝胶电泳 51

2.3.4.1 脉冲凝胶电泳的原理及装置 51

2.3.4.2 脉冲凝胶电泳DNA的制备 53

2.4 RNA琼脂糖凝胶电泳 54

2.3.4.3 脉冲电场凝胶电泳 54

2.4.1 戊二醛变性电泳 55

2.4.2 甲醛变性电泳 56

2.5 DNA聚丙烯酰胺凝胶DNA电泳 57

2.5.1 未变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 57

2.5.2 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 59

2.5.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳中的常见问题及解决办法 60

2.6.1 非变性圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳分离RNA 61

2.6 RNA聚丙烯酰胺凝胶电泳 61

2.6.2 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离RNA 62

2.6.2.1 甲酰胺凝胶 63

2.6.2.2 尿素凝胶 64

2.7 蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 64

2.7.1 SDS聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳 64

2.7.2 非变性不连续凝胶电泳 65

2.7.3 蛋白质染色检测 66

2.7.3.1 考马斯亮蓝染色 66

2.7.3.2 银染 66

2.7.3.3 其他蛋白质染色方法 67

2.8.1 凝胶干燥 68

2.8.1.1 SDS聚丙烯酰胺凝胶的干燥 68

2.8.1.2 测序聚丙烯酰胺凝胶的干燥 68

2.8 放射自显影和荧光自显影检测 68

2.8.2.1 预曝光X光片 69

2.8.2.2 放射自显影 69

2.8.3 荧光自显影 69

2.8.2 放射自显影 69

2.8.1.3 琼脂糖凝胶的干燥 69

2.9 从凝胶中回收和纯化生物大分子 70

2.9.1 DNA的回收 70

2.9.1.1 压碎浸泡法 70

2.9.1.2 透析袋电洗脱法 71

2.9.1.3 低熔点琼脂糖凝胶法 71

2.9.1.4 DEAE-纤维素膜法 72

2.9.1.5 琼脂糖酶法 73

2.9.1.6 回收DNA的纯化处理 73

2.9.2 RNA的回收 74

2.10 凝胶电泳中常见的问题 75

2.9.3 蛋白质的回收 75

第3章 常用载体 78

3.1 质粒 78

3.1.1 质粒的性质 78

3.1.1.1 质粒的复制 78

3.1.1.2 质粒的不相容性 79

3.1.1.3 选择标记 79

3.1.1.4 移动性 80

3.1.1.5 质粒的分类 80

3.1.2.1 插入失活筛选 81

3.1.2.2 α互补筛选 81

3.1.1.6 质粒载体的优缺点 81

3.1.2 常用筛选方法 81

3.1.2.3 直接筛选 82

3.1.2.4 限制酶图谱筛选 82

3.1.2.5 表达筛选 83

3.1.2.6 核酸探针筛选 83

3.1.3.4 pKK223-2 84

3.1.3.3 pGEM-3Z 84

3.1.3.2 pUC18 84

3.1.3 常用质粒载体图谱 84

3.1.3.1 pBR322 84

3.1.3.5 nAN13 85

3.2 λ噬菌体 85

3.2.1 λ噬菌体的性质 85

3.2.1.1 λ噬菌体基因组 85

3.2.1.2 裂解生长 86

3.2.1.3 溶源生长 88

3.2.1.4 选择λ噬菌体载体和宿主 88

3.2.2.2 cI基因插入失活筛选 90

3.2.2.3 Spi筛选 90

3.2.1.5 λ噬菌体的优缺点 90

3.2.2.1 α—互补筛选 90

3.2.2 常用筛选方法 90

3.2.2.4 包装片段筛选 91

3.2.2.5 同源重组筛选 91

3.2.2.6 用表达载体筛选 92

3.2.2.7 核酸探针筛选 92

3.2.3 常用λ噬菌体载体图谱 92

3.2.3.6 λZAP/R 93

3.3 丝状噬菌体 93

3.2.3.5 λDASH 93

3.3.1 丝状噬菌体的性质 93

3.3.1.1 丝状噬菌体的性质 93

3.2.3.3 λgt10 93

3.2.3.2 EMBL3 93

3.2.3.1 卡龙40 93

3.2.3.4 λgt11 93

3.3.1.2 丝状噬菌体载体的优缺点 95

3.4 噬粒 97

3.4.1 噬粒的性质 97

3.4.1.1 噬粒的组成 97

3.3.3 常用单链噬菌体载体图谱 97

3.3.2 常用筛选方法 97

3.4.1.2 噬粒载体的优缺点 98

3.4.2 载体的使用 98

3.4.3 常用噬粒载体图谱 98

3.4.3.1 pUC118 98

3.4.3.2 pGEM-3Zf 99

3.4.3.3 pBS SK 99

3.4.3.4 M13KO7 99

3.5 粘粒 99

3.5.1 粘粒的性质 99

3.5.1.1 粘粒的组成 99

3.5.1.2 粘粒中克隆 100

3.5.1.3 粘粒载体的优缺点 101

3.5.2 载体的使用 102

3.5.2.1 双酶切载体定向克隆 102

3.5.2.2 双cos位点载体克隆 102

3.5.2.3 体内重组 102

3.5.3 常用粘粒载体图谱 105

3.5.3.3 pWE15 106

3.6 卡粒 106

3.6.1 卡粒的性质 106

3.5.3.2 c2RB 106

3.5.3.1 pJB8 106

3.6.2 载体的使用 107

3.6.3 常用卡粒载体图谱 107

3.7 酵母克隆载体 107

3.7.1 酵母载体的性质 107

3.7.2 用酵母载体克隆 109

3.7.3 常用酵母载体图谱 110

3.7.3.1 YIp5 110

3.7.3.2 YRp7 110

3.7.3.3 YEp24 110

3.8.1 植物克隆载体的性质 111

3.8 植物克隆载体 111

3.7.3.4 Ycp50 111

3.7.3.5 YAC3 111

3.7.3.6 pJS97/pJS98 111

3.8.2 常用植物载体图谱 112

3.8.2.1 pGV3850 112

3.8.2.2 Bin19 112

3.9 动物细胞克隆载体 113

第4章 DNA的制备 115

4.1 质粒DNA的分离纯化 115

4.1.1 简介 115

4.1.2.2 碱裂解法 117

4.1.2 微量提取质粒DNA 117

4.1.2.1 煮沸法 117

4.1.2.3 96-孔微量滴定板法 118

4.1.2.4 直接测定菌落中质粒大小 118

4.1.3 大量提取质粒DNA 119

4.1.3.1 细菌的收集 119

4.1.3.2 碱裂解法 119

4.1.3.3 煮沸法 120

4.1.3.4 Triton裂解法 120

4.1.4.1 PEG沉淀法 121

4.1.4 纯化质粒DNA 121

4.1.4.2 氯化绝/澳化乙锭平衡高心法 122

4.2 λ噬菌体DNA的分离纯化 123

4.2.1 λ噬菌体的噬菌斑纯化 123

4.2.1.1 通过系列稀释滴定分离单噬菌斑 123

4.2.1.2 通过划线接种法分离单噬菌斑 124

4.2.1.3 挑取λ噬菌斑 124

4.2.2.1 平板裂解法 125

4.2.2.2 液体裂解法 125

4.2.2 制备λ噬菌体原液 125

4.2.2.3 噬菌体裂解液的保存 126

4.2.3 制备噬菌体DNA 126

4.2.3.1 从大量液体裂解物中制备DNA 126

4.2.3.2 从少量液体裂解物中制备DNA 127

4.3 单链噬菌体DNA的分离纯化 128

4.3.1 M13噬菌体的噬菌斑纯化 128

4.3.2 M13噬菌体单链DNA的制备 128

4.4.1.1 微量制备法 129

4.4.1 细菌基因组DNA的制备 129

4.4 染色体DNA的分离纯化 129

4.3.3 M13噬菌体双链DNA的制备 129

4.4.1.2 大量制备法 130

4.4.1.3 从基因组DNA制备液中除去存在的多糖 131

4.4.2 从植物组织提取基因组DNA 131

4.4.3 从哺乳动物组织提取基因组DNA 132

4.4.4 琼脂糖凝胶电泳 133

4.4.5 DNA蔗糖梯度分级分离 133

4.5 用有机溶剂抽提、纯化和浓缩核酸 134

4.5.1 酚∶氯仿抽提、乙醇沉淀纯化核酸 134

4.6 核酸色谱 135

4.5.2 用正丁醇浓缩DNA 135

4.5.3 乙醇沉淀除去低分子量的寡核苷酸和三磷酸 135

4.6.1 羟磷灰石柱分离单链和双链核酸 137

4.6.2 凝胶过滤色谱 137

4.6.2.1 Sephadex的制备 137

4.6.2.2 常规柱色谱 137

4.6.2.3 离心柱色谱 137

4.6.2.4 Sepharose CL-4B分级分离cDNA 138

5.1 RNA的制备 139

5.1.1 制备RNA时的注意事项 139

第5章 RNA的制备和分析 139

5.1.2 细菌RNA的制备 140

5.1.2.1 从革兰氏阳性细菌中分离RNA 140

5.1.2.2 从革兰氏阴性细菌中快速分离RNA 141

5.1.3 动物细胞RNA制备 142

5.1.3.1 从培养细胞制备总RNA 142

5.1.3.2 从组织中制备总RNA 143

5.1.3.3 从培养细胞中制备细胞质RNA 143

5.1.4 植物细胞RNA制备 144

5.1.5.1 寡聚(dT)纤维素纯化mRNA 146

5.1.5 多聚(A)RNA的纯化 146

5.1.5.2 生物素标记寡聚(dT)纯化mRNA 147

5.1.5.3 用DNA纯化特定的mRNA 147

5.1.6 分级分离RNA 148

5.1.6.1 羟甲基汞琼脂糖凝胶电泳 148

5.1.6.2 羟甲基汞蔗糖梯度离心 149

5.1.7 RNA制品的质量 150

5.2 RNA分析 150

5.2.1 S1分析 151

5.2.1.1 M13单链模板法 151

5.2.1.3 寡核苷酸探针法 154

5.2.1.2 质粒双链模板法 154

5.2.1.4 mRNA S1定量分析的条件 155

5.2.1.5 S1分析经常出现的问题 156

5.2.2 RNA酶保护分析 156

5.2.2.1 RNA酶保护分析 156

5.2.2.2 凝胶电泳纯化RNA探针 159

5.2.3 引物延伸 159

5.2.4 Northern杂交 161

5.2.4.1 RNA甲醛变性电泳 161

5.2.5 斑点杂交 163

5.2.4.2 RNA乙二醛/DMSO变性电泳 163

第6章 DNA文库的构建 165

6.1 构建文库需考虑的问题 165

6.1.1 载体 166

6.1.2 外源DNA 166

6.1.3 外源DNA片段与载体连接 167

6.1.4 重组DNA导入E.coli 169

6.1.5 文库筛选及保存 169

6.2 构建基因组文库 169

6.2.1 载体 169

6.2.2 外源片段 170

6.2.2.1 基因组DNA文库的构建 171

6.2.2.2 磷酸酶处理过的噬菌体臂包装效率的测定 171

6.2.3 构建基因组文库的特殊方法 172

6.2.3.1 部分填补法 172

6.2.3.2 精简基因组文库 173

6.2.4 构建基因组文库中常见的问题 174

6.3 构建cDNA文库 174

6.3.1 mRNA的数量和质量 174

6.3.2.1 cDNA第一链的合成 175

6.3.2 cDNA的合成 175

6.3.2.2 cDNA第二链的合成 176

6.3.2.3 cDNA合成效率的测定 179

6.3.3 cDNA克隆 180

6.3.3.1 利用接头克隆 180

6.3.3.2 利用引物-转接头克隆 180

6.3.3.3 同聚尾克隆 180

6.3.3.4 Okayama-Berg载体克隆 181

6.3.3.5 单链载体中克隆 181

6.3.3.6 mRNA-cDNA克隆 182

6.3.4 精简cDNA文库 186

6.3.4.1 精简DNA文库的建立 187

6.3.5 cDNA克隆中常见的问题 189

6.4 文库的扩增和贮存 189

6.4.1 λ噬菌体文库的扩增 189

6.4.2 粘粒文库的扩增 192

6.4.2.1 粘粒和质粒基因文库的扩增 192

6.5 文库的筛选 193

6.5.1 文库的转移和复制 193

6.5.1.1 λ噬菌体文库的转移 193

6.5.1.2 粘粒及质粒文库的转移 194

6.5.2 杂交筛选 195

6.5.2.1 用DNA片段作为探针 195

6.5.2.2 在甲酰胺溶液中杂交 195

6.5.2.3 用人工合成的寡核苷酸作为探针 196

6.6 亚克隆 198

6.6.1 DNA片段的亚克隆 199

6.6.2 用低熔点琼脂糖亚克隆 200

7.1 E.coli的转化 201

7.1.1 CaCl2制备感受态E.coli细胞及其转化 201

第7章 重组DNA导入宿主 201

7.1.2 电激高效转化 202

7.2 λ噬菌体体外包装 204

7.2.1 从一种溶源菌中制备包装提取物及包装 205

7.2.2 从两种溶源菌中制备包装提取物及包装 206

7.2.2.1 超声波提取物的制备 206

7.2.2.2 冻融裂解物的制备 207

7.2.2.3 体外包装 207

7.3.2 插入方向的确定 208

7.3.1 噬菌体DNA导入细胞 208

7.3 单链噬菌体转染 208

7.4 酵母细胞的转化 209

7.4.1 原生质体法转化酵母 209

7.4.2 乙酸锂法转化酵母 210

7.5 动物细胞的转化 210

7.5.1 磷酸钙转染法 211

7.5.2 DEAE-葡聚糖转染法 212

7.5.2.1 用DEAE-葡聚糖转染细胞 212

7.5.2.2 大量细胞的DEAE-葡聚糖转染 213

7.5.2.3 悬浮细胞的DEAE-葡聚糖转染 214

7.5.3.1 动物细胞电激转染法 215

7.5.3 电激法 215

7.5.3.2 植物原生质体电激转染法 216

7.5.4 脂质体转染法 216

7.5.4.1 用脂质体进行瞬时表达 216

7.5.4.2 用脂质体进行稳定转化 217

7.5.5 转染方法的优化 218

7.6 植物细胞的转化 220

7.6.1 农杆菌介导的植物细胞转化 220

7.6.1.1 培养法 220

7.6.1.2 叶盘法 221

7.6.1.3 活体接种与共感染法 222

7.6.2 利用PEG的植物细胞转化 224

第8章 基因表达 226

8.1 基因在E.coli细胞中表达 226

8.1.1 表达戴体结构 226

8.1.2 融合蛋白表达戴体 227

8.1.2.1 表达融合蛋白的优点及其载体 227

8.1.2.2 表达载体的构建和融合蛋白的检测 227

8.1.2.3 制备用于产生抗体的融合蛋白 228

8.1.3.1 原核基因的表达载体 229

8.1.3 天然蛋白表达载体 229

8.1.3.2 真核基因的表达载体 231

8.1.4 其他表达载体 232

8.1.4.1 分泌型表达载体 232

8.1.4.2 切割型表达载体 234

8.1.5 提高表达效率 235

8.1.6 检测基因表达 235

8.1.6.1 检测基因表达的方法 235

8.2 基因在哺乳动物中表达 236

8.2.1 哺乳动物表达系统的用途 236

8.1.6.2 用β半乳糖苷酶活性检测表达 236

8.2.2 哺乳动物表达载体 237

8.2.2.1 原核DNA序列 237

8.2.2.2 启动子 237

8.2.2.3 增强子 237

8.2.2.4 拼接信号 237

8.2.2.5 终止信号和多聚腺苷化信号 238

8.2.2.6 筛选标记 238

8.2.2.7 真核病毒序列 240

8.2.3 几种常见的真核病毒载体 240

8.2.3.1 SV40载体 240

8.2.3.2 BPV载体 242

8.2.3.3 EBV载体 243

8.2.3.4 反转录病毒载体 243

8.2.3.5 痘病毒载体 244

8.2.4 外源DNA序列 246

8.2.5 宿主与载体系统 246

8.2.5.1 瞬时表达系统 247

8.2.5.2 稳定表达系统 247

8.2.5.3 转染DNA的扩增和诱导 248

8.2.7 融合基因的用途 250

8.2.6 转染方法 250

8.3 用杆状病毒载体在昆虫细胞中表达基因 253

8.3.1 杆状病毒生活周期 254

8.3.2 杆状病毒表达系统 255

8.3.3 用杆状病毒表达系统大量表达蛋白质 255

第9章 核酸方法筛选鉴定重组子 257

9.1 构建DNA酶切图谱 257

9.1.1 双酶切法 257

9.1.2 部分酶切法 258

9.1.3 BAL 31酶切法 261

9.2 探针的制备 262

9.1.4 双向电泳末端标记法 262

9.2.1 双链DNA探针 263

9.2.1.1 切口平移法 263

9.2.1.2 随机引物合成法 265

9.2.2 单链DNA探针 266

9.2.2.1 从M13载体衍生序列合成探针 266

9.2.2.2 从RNA合成单链cDNA探针 267

9.2.3 末端标记DNA探针 268

9.2.3.2 前向反应标记5＇末端 269

9.2.3.1 Klenow片段标记3＇末端 269

9.2.3.3 交换反应标记5＇末端 271

9.2.4 寡核苷酸探针 272

9.2.4.1 寡核苷酸探针的类型及标记方法 272

9.2.4.2 T4多核苷酸激酶标记寡核苷酸 273

9.2.4.3 乙醇沉淀纯化放射性标记寡核苷酸 274

9.2.4.4 酸沉淀法测定DNA和KNA中的放射强度 275

9.2.4.5 柱色谱分离放射性标记的DNA 276

9.2.5 RNA探针 276

9.2.6.1 生物素标记探针 277

9.2.6.2 地高辛配基标记探针 277

9.2.6 非放射性探针 277

9.2.6.3 辣根过氧化物酶标记探针 278

9.3 分子杂交 278

9.3.1 简介 278

9.3.1.1 分子杂交种类 278

9.3.1.2 反应条件对杂交的影响 278

9.3.2 Southern杂交 280

9.3.2.1 简介 280

9.3.2.2 Southern转移和杂交方法 281

9.3.5 菌落原位杂交 285

9.3.5.1 菌落原位杂交 285

9.3.4 斑点杂交 285

9.3.3 Northern杂交 285

9.3.5.2 λ噬菌斑原位杂交 287

9.4 基因在染色体上定位 288

9.4.1 染色体跳移 288

9.4.2 染色体步移 290

9.4.3 染色体缓移 290

第10章 蛋白质检测和分析 292

10.1 蛋白质抽提 292

10.2.2 Lowry方法 293

10.2 蛋白质定量 293

10.2.1 Bradford方法 293

10.3 常规色谱 294

10.3.1 凝胶过滤 294

10.3.2 离子交换色谱 297

10.3.3 亲和色谱 300

10.3.4 疏水相互作用色谱 302

10.3.5 纸上分配色谱 302

10.3.6 液液分配色谱 302

10.3.7 共价色谱 302

10.3.9 常规色谱问题处理 303

10.3.8 金属螯合色谱 303

10.4 高效液相色谱 304

10.4.1 反相高效液相色谱 304

10.4.2 离子交换高效液相色谱 306

10.4.3 体积排阻高效液相色谱 308

10.4.4 高效聚焦色谱 309

10.4.5 高效疏水相互作用色谱 309

10.5 抗体的制备 309

10.5.1 多克隆抗体的制备 310

10.5.1.1 肌肉注射免疫 311

10.5.1.3 皮下免疫 312

10.5.1.2 皮肉免疫 312

10.5.1.4 从耳动脉放血 313

10.5.2 利用合成多肽制备抗体 313

10.5.3 单克隆抗体的制备 314

10.5.4 抗体的纯化 315

10.5.4.1 蛋白A纯化 315

10.5.4.2 细胞抽提物吸附纯化 316

10.6.1 免疫沉淀 318

10.6 免疫学测定 318

10.6.1.1 放射性标记表达目的蛋白质的细胞 319

10.6.1.2 裂解细胞 320

10.6.1.3 收集纯化抗原-抗体复合物 322

10.6.1.4 凝胶电泳和放射自显影分析 323

10.6.2 酶联免疫吸附测定法 324

10.6.2.1 辣根过氧化物酶标记抗体 325

10.6.2.2 ELISA 326

10.6.3 固相放射免疫测定 328

10.6.3.1 氯胺T碘化标记抗体 329

10.6.3.2 双抗体固相放射免疫测定 330

10.6.4 Western印迹 331

10.6.4.1 Western印迹 332

10.6.4.2 固定在滤膜上蛋白质的染色 333

10.6.5 荧光标记法 334

10.6.6 免疫检测中常见问题的处理 334

10.7 克隆基因的体外转录和体外翻译 337

11.1 双脱氧链末端终止法 341

11.1.1 简介 341

第11章 核酸测序 341

11.1.2 反应前的准备 343

11.1.2.1 反应的设计 343

11.1.2.2 反应的材料 343

11.1.3 测序的策略 345

11.1.3.1 随机法 345

11.1.3.2 互套缺失法 346

11.1.3.3 引物延伸法 353

11.1.4 模板的制备 354

11.1.4.1 单链噬菌体模板的制备 354

11.1.5 双脱氧链终止反应 355

11.1.4.2 变性双链模板的制备 355

11.1.6 凝胶电泳和放射自显影 356

11.1.7 双脱氧测序法中常见问题 358

11.2 化学法 360

11.2.1 简介 360

11.2.2 反应前的准备 361

11.2.3 模板的制备 363

11.2.4 化学裂解反应 363

11.3.1 化学发光测序 366

11.3 其他测序方法 366

11.2.5 化学测序法中常见问题 366

11.3.2 多重测序 367

11.3.3 自动测序 367

11.3.4 用PCR测序 367

11.3.5 磁铁珠分离单链测序 368

第12章 定位诱变 369

12.1 缺失诱变 369

12.1.1 简单缺失 369

12.1.2.3 DNA酶Ⅰ 370

12.1.2.2 BAL 31 370

12.1.2.1 核酸外切酶Ⅲ 370

12.1.2 系统缺失 370

12.1.2.4 T4 DNA聚合酶 371

12.2 插入诱变 371

12.2.1 简单插入 371

12.2.2 系统插入 372

12.2.2.1 在Mn2+存在下DNA酶?酶切后插入诱变 372

12.2.2.2 接头扫描诱变 372

12.2.2.3 TAB接头诱变 375

12.3.1 诱变寡核苷酸的设计 376

12.3 利用寡核苷酸诱变 376

12.3.2 目的DNA模板的制备 377

12.3.2.1 单链目的DNA模板的制备 377

12.3.2.2 双链目的DNA模板的制备 378

12.3.3 合成DNA突变体 378

12.3.3.1 双引物法 378

12.3.3.2 异源双链法 379

12.3.3.3 核酸外切酶法 380

12.3.3.4 盒式诱变法 381

12.3.4 筛选突变体 382

12.3.5 提高诱变效率 383

12.3.5.1 利用尿嘧啶进行诱变 384

12.4 酶法合成诱变 386

12.3.5.2 利用α-硫代dNTP诱变 386

12.5 随机化学诱变 389

12.5.1 化学诱变剂 389

12.5.1.4 肼诱变 390

12.5.2 化学诱变中的注意事项 390

12.5.1.5 弱酸诱变 390

12.5.2.1 载体损伤 390

12.5.1.3 亚硫酸盐诱变 390

12.5.1.2 羟胺诱变 390

12.5.1.1 亚硝酸诱变 390

12.5.2.2 突变的分布 391

12.5.2.3 目的片段的选择 391

12.5.2.4 载体的选择 391

第13章 聚合酶链反应(PCR) 393

13.1 PCR的用途 393

13.2 PCR的过程 394

13.2.1 原理 394

13.2.2 反应成分 394

13.2.2.1 引物 394

13.2.2.3 反应缓冲液 395

13.2.2.2 Taq DNA聚合酶 395

13.2.2.4 模板DNA 396

13.2.2.5 其他成分 396

13.2.3 反应参数 396

13.2.4 注意事项 398

13.3 PCR方法 399

13.3.1 快速扩增cDNA末端 399

13.3.2 反向PCR 401

13.3.3 用简并引物扩增cDNA 401

13.3.4 定量PCR 401

13.3.5 不对称PCR 402

13.3.6 引物竞争PCR 403

13.4 利用PCR进行分子克隆 403

13.4.1 利用PCR进行重组和诱变 403

13.4.2 利用PCR扩增RNA 406

13.4.3 利用PCR测序 407

13.4.3.1 常规PCR测序 407

13.4.3.2 不对称PCR测序 408

13.4.4 利用PCR定量DNA 409

1 实验室的安全 411

附录 411

2 分子生物学实验室设备 416

3 常用培养基及菌株 418

3.1 细菌培养基 418

3.1.1 液体培养基 418

3.1.2 固体培养基 420

3.2 λ噬菌体工作溶液 421

3.3 酶母培养基 422

3.4 植物基本培养基 422

3.5 常用E.coli菌株及基因型 424

3.6 常用抗菌素 426

4 常用试剂 427

4.1 常用溶液 427

4.2 其他酶制品 430

4.3 常用酶反应缓冲液 431

5 常用数据 433

5.1 核酸和蛋白质常数 433

5.1.1 常用数据及转换 433

5.1.2 三磷酸核苷酸分子量 433

5.1.3 氨基酸分子量 434

5.1.5 常用核酸和蛋白质分子量标准物 435

5.1.4 遗传密码 435

5.1.6 各种生物基因组长度 436

5.2 同位素数据 437

5.3 Tris·Cl 缓冲液pH值与温度关系 437

6 常用方法 438

6.1 细菌的培养和生长 438

6.1.1 细菌的液体培养 438

6.1.2 细菌的固体培养 438

6.2 器皿硅烷化 439

6.1.4 E.coli细胞常用数据 439

6.1.3 菌株保存和复壮 439

6.3 放射自显影 440

6.4 透析袋的处理 440

6.5 核酸常用方法 441

6.5.1 DNA和RNA的定量 441

6.5.2 核酸的抽提和沉淀 441

6.5.3 核酸浓缩 441

6.5.4 放射性测定 441

参考文献 443