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第1章 重组蛋白分离与分析概论 1

1.1 重组蛋白质概论 1

目录 1

1.2 重组蛋白质的设计及纯化技巧 2

1.3 纯化目标 5

1.3.1 产品的纯度和安全性 5

1.3.2 终产物成本 5

1.4 纯化策略 6

1.5 纯化过程的放大 7

1.7 合理设计纯化工艺 8

1.6 对纯化的综合评价 8

主要参考文献 11

第2章 重组蛋白纯化的一般工艺及方法 14

2.1 引言 14

2.2 用做纯化的主要蛋白质性质 14

2.2.1 蛋白质大小 15

2.2.2 蛋白质形状 15

2.2.3 蛋白质荷电性 15

2.2.8 蛋白质与配体结合能力 16

2.2.7 蛋白质密度 16

2.2.9 蛋白质与金属螫合能力 16

2.2.5 蛋白质疏水性 16

2.2.4 蛋白质等电点 16

2.2.6 蛋白质溶解度 16

2.2.10 蛋白质的某些特殊性质 17

2.3 纯化分离技术 18

2.3.1 发酵液的预处理 18

2.3.2 细胞分离技术 20

2.3.3 细胞破碎技术 24

2.3.4 生物物质的分离纯化技术 24

2.4 纯化方案中纯化顺序的选择 76

2.5 固定相的选择 77

2.6 方案的有效性分析 78

主要参考文献 79

3.2 破碎率的评价 81

第3章 细胞破碎的物理及化学方法 81

3.1 前言 81

3.3 破碎方法 82

3.3.1 球磨匀浆法 83

3.3.2 转子-定子式匀浆机匀浆 87

3.3.3 高压匀浆机匀浆 90

3.3.4 超声波破碎 94

3.3.5 其他物理方法 95

3.3.6 细胞自溶 98

3.3.7 酶解法 101

3.3.8 干燥法 102

3.3.9 其他化学溶剂法 103

3.3.11 通过细胞自身调控体系进行细胞的破碎 104

3.4 总结 104

主要参考文献 106

4.1 天然及变性蛋白的水解 108

4.1.1 蛋白酶的生化作用 108

第4章 纯化过程中如何防止蛋白水解 108

4.1.2 蛋白酶的种类和蛋白酶的作用机理 109

4.1.3 蛋白酶的特异性及对降解底物的敏感性 110

4.2 用作宿主细胞的真核、原核生物体内的蛋白酶 111

4.2.1 大肠杆菌（E.coli）内的蛋白酶 111

4.2.2 枯草杆菌（Bacillus subtilis）产生的蛋白酶 112

4.2.3 酵母中的蛋白酶 113

4.2.4 哺乳动物细胞内的蛋白酶 115

4.3 蛋白酶的鉴定 116

4.4 防止重组蛋白水解的策略 117

4.4.1 基因调控法 118

4.4.2 去除蛋白酶的策略 121

4.4.3 抑制蛋白酶的策略 122

主要参考文献 125

5.1 引言 127

5.1.1 蛋白质转译后的修饰及鉴定分析 127

第5章 从重组蛋白质中除去N末端甲硫氨酸的方法 127

5.1.2 甲硫氨酸氨基肽酶的特性 131

5.1.3 胞质间重组蛋白的加工 131

5.1.4 与多余甲硫氨酸相关的非均匀性和免疫原性 132

5.2 去除末端甲硫氨酸的方法 133

5.2.1 体内去除末端甲硫氨酸的方法 133

5.2.2 去除末端甲硫氨酸的体外方法 135

主要参考文献 137

第6章 药用蛋白质的纯化 141

6.1 引言 141

6.2 蛋白质纯化过程中的质量控制 142

6.2.1 蛋白质生物功效 142

6.2.2 蛋白质结构 143

6.2.3 蛋白质纯度的测定 143

6.2.4 终产品中痕量杂质的分析 143

6.3 蛋白质纯化准则 143

6.3.1 初始原料物质的浓度和杂质性质 144

6.3.2 非蛋白杂质的去除 145

6.3.3 DNA的去除 145

6.3.4 热源的去除 147

6.3.5 病毒的去除 149

6.3.6 外源蛋白的去除 150

6.4 方案的有效性 151

6.5 结论 152

主要参考文献 153

第7章 利用工程修饰改进重组蛋白的纯化分离 157

7.1 引言 157

7.2 引入切割位点的重组工程蛋白 158

7.3 促进活性蛋白分离的工程技术 159

7.3.1 形成包涵体以稳定蛋白质 160

7.3.2 基团修饰以利天然活性蛋白质生产 162

7.4 简化纯化工艺的蛋白质工程 163

7.4.1 改进色谱性能的蛋白质工程 164

7.4.2 构建工程位点使蛋白质具有免疫亲和性能 164

7.4.3 构建工程位点使蛋白质具有离子交换吸附性能 166

7.4.4 构建工程位点使蛋白质具有金属亲和吸附性能 168

7.4.5 低成本纯化蛋白工程 171

7.4.6 改进分析方法的蛋白质工程 171

7.5 结论 172

主要参考文献 173

第8章 大肠杆菌表达的重组蛋白的分离纯化 175

8.1 引言 175

8.2 大肠杆菌表达的分泌型重组蛋白的纯化分离 178

8.2.1 纯化方法 179

8.2.2 实例 180

3.3.10 细胞渗透法 193

8.2.3 分泌型重组蛋白的纯化分离总结 199

8.3 大肠杆菌表达的包涵体蛋白的纯化分离 200

8.3.1 确定包涵体量 201

8.3.2 重组蛋白稳定性检测 204

8.3.3 纯化方案 206

8.3.4 包涵体的组成分析 210

8.3.5 包涵体的结构 214

8.3.6 影响包涵体形成的因素 214

8.3.7 包涵体蛋白纯化实例 216

8.3.8 包涵体蛋白纯化总结 221

主要参考文献 221

第9章 酵母表达的重组蛋白的分离纯化 225

9.1 引论 225

9.2 酿酒酵母或面包酵母表达的重组蛋白的分离纯化 227

9.2.1 酿酒酵母或面包酵母表达的胞内蛋白质的分离纯化 228

9.2.2 酿酒酵母或面包酵母分泌表达的蛋白质的分离纯化 232

9.2.3 结论 234

9.3.1 背景 235

9.2.4 酿酒酵母或面包酵母表达的重组蛋白的研究展望 235

9.3 Pichia pastoris生产的重组蛋白的分离纯化 235

9.3.2 Pichia pastoris表达体系的发展 236

9.3.3 P.pastoris表达的胞内外源蛋白 239

9.3.4 Pichia pastoris分泌的外源蛋白的分离纯化 242

9.3.5 讨论 248

主要参考文献 249

第10章 单克隆抗体的纯化 252

10.1 引言 252

10.2 单克隆抗体制备过程 253

10.3 抗体的物理特征 257

10.4 单克隆抗体纯化工艺 258

10.4.1 澄清 258

10.4.2 沉淀 260

10.4.3 分离 260

10.4.4 非蛋白杂质的去除 271

附录 鼠源性病毒检测 273

主要参考文献 274