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第一节 分子生物学的理论和技术是肝炎病毒研究的重要手段 1

一、丙肝病毒和戊肝病毒的发现从基因水平上取得突破 1

第一章 肝炎病毒的分子生物学概论 1

二、分子生物学技术是肝炎病毒病原学检测的重要手段 2

三、HBV DNA转染细胞系的建立为HBV的研究提供了体外繁殖体系 3

第二节 分子生物学技术是病毒性肝炎发病机制的研究手段 4

一、分子杂交技术原位检测肝炎病毒的核酸成分 4

二、HBV DNA原位表达与HBcAg表达方式及其与病理改变的关系 4

三、转基因动物是研究HBV等肝炎病毒致病机制的合适的模型 4

一、HBV DNA复制是研究逆转录过程的一个很好的模型 5

二、HBV DNA复制过程是研究转录物剪切加工机制的模型 5

第三节 肝炎病毒的分子生物学研究可丰富分子生物学的理论 5

三、HBV DNA的研究也是基因表达调控的一个重要手段 6

第四节 用分子生物学技术探索抗肝炎病毒治疗的新途径 6

一、分泌抗病毒物质的抗肝炎病毒基因治疗 7

二、利用肝炎病毒的反式调节机制探讨抗肝炎病毒治疗的新方法 7

三、反义技术抗肝炎病毒治疗方法 8

第五节 肝炎病毒分子生物学内容 9

一、肝炎病毒的基因结构和功能 9

二、肝炎病毒基因表达和调控 9

三、抗肝炎病毒新方法的探讨 9

第二章 甲型肝炎病毒的分子生物学 11

第一节 HAV基因结构 11

一、5′非翻译区 14

三、3′非翻译区 15

第二节 HAV基因组编码产物 15

二、编码区 15

一、P1区 16

二、P2区 16

三、P3区 16

第三节 HAV的复制 17

一、HAV体外增殖 17

二、HAV在体内的生活周期 17

一、HAV基因组核酸变异 18

二、HAV氨基酸序列变异 18

第四节 HAV变异及分型 18

三、HAV分型 19

第五节 HAV抗原结构 19

第六节 HAV减毒与细胞培养适应化的分子基础 20

一、HAV野毒株与减毒株核苷酸比较 20

二、2B和2C区基因突变 21

三、5′-NTR对HAV体外生长的影响 22

第七节 HAV疫苗的研究进展 22

一、HAV灭活疫苗 22

二、HAV减毒活疫苗 23

三、基因工程疫苗 23

第一节 HBV基因组 25

一、顺向重复序列 25

第三章 乙肝病毒基因的结构与功能 25

二、S基因区 29

三、C基因区 30

四、P基因区 31

五、X基因区 31

第二节 HBV的复制 31

一、HBV进入肝细胞 31

二、HBV细胞内移行 32

三、超螺旋双链HBV DNA的形成 32

四、HBV DNA 前基因组的合成与装配 32

六、HBV颗粒的装配与释放 33

五、HBV DNA双链的形成 33

第三节 HBV DNA的转录 34

第四节 HBV结构蛋白 37

一、包膜蛋白 37

二、核心区蛋白 39

三、HBV DNA多聚酶蛋白 41

四、HBV的X蛋白 42

第四章 丙肝病毒的分子生物学 44

第一节 HCV基因的克隆化 44

一、HCV是一种RNA病毒 44

二、5-1-1片段的克隆 45

三、HCV基因组克隆化的意义 46

二、中国河北株与美、日株一级结构的比较 47

一、丙肝病毒基因的一级结构 47

第二节 丙肝病毒的基因结构 47

三、中国丙型肝炎病毒河北流行株和上海流行株核脊酸序列的比较 55

四、中国丙型肝炎病毒基因组克隆的方法 57

第三节 HCV基因组变异及分型 58

一、HCV 基因组分型的基础 59

二、HCV基因组分型的方法 59

三、HCV基因组分型的意义 62

第四节 丙肝病毒蛋白的翻译 63

一、HCV蛋白编码的基因结构 64

二、核糖体与HCV 5′-NTR结合的方式 65

三、HCV病毒蛋白的裂解产物 66

四、HCV病毒多蛋白的裂解酶NS3 67

第五节 丙肝病毒感染的分子诊断 68

一、HCV基因组扩增技术 68

二、重组HCV抗原 69

三、人工合成HCV抗原 69

四、第一代抗-HCV检测方法 70

五、第二代抗-HCV检测方法 71

六、抗-HCV lgM的检测 72

七、HCV核酸和蛋白的原位表达 73

第五章 丁型肝炎病毒的分子生物学 77

第一节 HDV的结构特性 77

第二节 HDV的基因组和抗基因组 78

一、HDV基因组的一级结构的发现 78

二、HDV抗基因组RNA 88

第三节 HDV的复制 90

一、研究HDV基因组复制的实验系统 91

二、HDV RNA 复制的代谢需要 92

三、亚基因组mRNA 92

四、翻译 92

五、嗜肝DNA病毒在HDV基因组复制中的作用 92

六、HDAg在HDV复制中的作用 93

七、自身裂解 95

八、自连 98

九、HDV（复制）对HBV的影响 98

二、两种蛋白的结构区及意义 99

一、HDAg的一般特性 99

第四节 HDV的蛋白质 99

三、HDAg’的发现及特性 102

四、28kDa的发现 103

第五节HDV的分子生物学内容在诊断、治疗及预防等中的应用 103

一、诊断上的应用 103

二、治疗上的应用 104

三、预防上的应用 105

四、其它的应用 105

第六章 戊型肝炎病毒的分子生物学 110

第一节 HEV基因片段的克隆化 110

一、原始材料 110

三、HEV cDNA克隆的结果 111

二、HEV cDNA克隆化实验流程 111

四、HEV cDNA ET1.1成功的意义 112

第二节 HEV基因组的结构 113

一、HEV核苷酸的一级结构 113

二、HEV cDNA全序列克隆策略 116

三、不同株的一级序列比较 117

四、戊肝病毒基因组与其它肝炎病毒基因组的比较 120

五、HEV RNA的二级结构 121

第三节 HEV 基因组表达研究 122

一、HEV RNA 开放读框分析 122

二、翻译方式 123

一、HEV蛋白在克隆载体中的表达 124

第四节 HEV基因重组表达与突变 124

三、HEV抗原的表位 124

二、HEV病毒蛋白融合基因的表达 125

三、HEV基因组的变异与突变 126

第五节 HEV的生活周期与体外培养 127

一、HEV的生活周期 127

二、HEV的细胞培养 128

第六节 HEV的分子免疫学 129

一、HEV病毒抗原 129

二、HEV病毒蛋白的抗原决定簇 129

三、HEV抗原在肝脏中的表达 130

四、HEV表达人B细胞抗原表位* 131

二、GBVs和HGV的基因构成及相应特性 134

第七章 庚型肝炎病毒和GB病毒的分子生物学 134

一、概况 134

三、GBVs和HGV的结构蛋白 137

第八章 乙肝病毒DNA转染细胞系的建立和应用 141

第一节 HBV DNA转染细胞系的建立 141

一、HBV DNA口的基因 141

二、靶细胞的选择 143

三、基因转移方法 146

第二节 HBV DNA转染细胞系复制和表达的特点 146

一、HBV DNA转染细胞系中HBV DNA的存在状态 147

二、HBV DNA 转染细胞系中HBV DNA复制特点 148

三、HBV DNA 转染细胞中的转录产物 149

四、HBV蛋白的表达 151

五、转染细胞中HBV DNA表达调控 153

六、HBV颗粒的装配 155

第三节 乙肝病毒基因组转染细胞系的应用 156

一、HBV结构基因的表达 156

二、HBV DNA调控研究 158

三、HBV DNA突变研究 160

四、HBV致病机制研究 160

五、HBV感染与肝细胞癌的关系 161

六、HBV DNA的转染在HDV研究中的应用 162

第四节 转染细胞系在抗HBV药物研究中的应用 163

一、病毒基因组复制 163

二、病毒的转录 164

三、蛋白的表达 165

四、药物结构和抗HBV活性关系 166

第九章 乙肝病毒的基因突变研究 169

第一节 人工突变研究方法 169

一、直接的缺失与插入突变 169

二、系列缺失突变体构建 169

三、人工合成方法 170

四、PCR扩增法 171

五、寡核苷酸定点诱变 171

六、盒式突变 173

一、突变体的构建 174

第二节 直接重复序列的突变 174

二、DR区突变的意义 175

第三节 S ORF区基因突变 176

一、前S1区突变 176

二、前S2基因突变 179

三、S基因突变 180

第四节 C ORF区基因突变 182

一、前C区突变 182

二、C区突变 183

第五节 P ORF和X ORF的突变 183

一、R ORF的突变 183

二、X ORF的突变 184

一、S1核酸酶作用 186

第十章 乙肝病毒复制和表达的调控 186

第一节 基因调控的研究方法 186

二、引物延伸实验 187

三、基因突变法 188

四、体外转录系统 188

五、报道基因技术 189

六、异种启动子表达实验 190

七、尾随序列的置换与突变 190

第二节 HBV基因调节的结构基础 190

一、增强子序列 190

二、HBV基因的启动子 191

二、前基因组RNA转位与HBV DNA复制 196

一、HBV DNAP突变与HBV DNA复制 196

第三节 HBV DNA复制的调节 196

三、HDV基因共转染对HBV复制的影响 197

四、影响HBV DNA复制的细胞因子 197

第四节 HBV DNA 转录物的剪切与调节 198

一、HBV DNA转录物的种类和功能 198

二、HBV DNA转录物剪切现象的发现 199

三、HBV DNA转录物剪切机制* 199

四、HBV DNA转录物的剪切特点 200

第十一章 乙肝病毒与细胞因子 203

第一节 影响HBV DNA表达调控的细胞因子 203

一、HBV感染的免疫应答 203

二、细胞因子的应答 205

三、转录调节因子的应答 208

第二节 干扰素与乙肝病毒 208

一、HBV感染导致IFN系统的改变* 209

二、干扰素对HBV复制与表达的影响 209

三、HBV DNA的复制和表达对IFN的影响 211

第三节 白细胞介素-2与乙肝病毒 214

一、IL-2抗病毒作用的发现 214

二、IL-2的抗乙肝病毒作用 214

三、IL-2抗HBV作用的机制 216

四、IL-2转基因表达抗病毒基因治疗的优势 217

一、病因学 219

第一节 肝炎病毒致肝细胞癌的证据 219

第十二章 肝炎病毒与肝细胞癌 219

二、流行病学 220

三、动物模型和转基因动物 222

四、转染细胞的模型 222

五、肝炎病毒与癌基因的激活 223

第二节 HBV DNA整合与HCC 223

一、HBV DNA在肝细胞基因中的整合 224

二、HBV DNA整合与HCC间的相互关系 226

三、HBV DNA整合区的细胞基因重排 226

四、乙型肝炎病毒致原发性肝癌模式 229

二、X抗原对癌基因的激活 230

一、X基因ORF的结构和作用 230

第三节 HBV DNA X基因与HCC 230

三、X基因研究的意义 231

第四节 癌基因与HCC 231

一、抗癌基因P53与肝细胞癌 232

二、癌基因与肝细胞癌 234

第五节 HCV和HCC 236

一、原发性肝癌的抗-HCV检测 237

第十三章 乙肝病毒蛋白质的基因工程表达 239

第一节 HBV蛋白基因工程表达的条件 239

一、表达细胞宿主 239

三、HBV DNA基因片段 241

二、表达载体 241

第二节 原核细胞表达系统 242

第三节 酵母菌表达系统 242

常用的酵母克隆载体 242

启动子的选择 243

第四节 哺乳动物细胞表达系统 243

一、表达的策略 244

二、小蛋白的表达 244

三、中蛋白的表达 245

四、大蛋白的表达 245

第五节 非包膜蛋白的基因工程表达 246

二、多聚酶的表达及HBxAg的表达 247

一、核心基因的表达 247

第十四章 乙肝病毒转基因小鼠 250

第一节 转基因动物的发展 250

一、早期的转基因动物 251

二、转基因动物中基因的表达 251

三、外源基因的表达对转基因动物的影响 252

第二节 转基因动物的建立方法 252

一、外源基因的准备 253

二、生殖细胞的准备 253

三、外源基因导入受精卵的方法 253

五、转基因动物的鉴定 254

四、受体动物的准备及转导受精卵的植入 254

第三节 转基因动物的应用 255

一、肿瘤研究 255

二、免疫学研究 256

三、动物品种的改良 257

四、基因表达的调节和控制 257

五、生物工厂 258

第四节 乙肝病毒转基因小鼠 258

一、乙肝病毒概况 259

二、乙肝病毒转基因小鼠的建立 260

三、病毒基因表达的调控 260

四、病毒基因组的复制 263

五、病毒蛋白的合成 263

七、重排序列的不稳定性 264

六、转基因动物中的HBV致病性 264

第十五章 肝炎病毒基因组的PCR扩增 267

第一节 PCR技术的原理 267

一、PCR技术的理论根据* 267

二、PCR技术的基本过程 268

三、PCR技术的影响因素 268

四、PCR技术的类型 270

第二节 几种新型的PCR技术 271

一、定量PCR技术 271

二、原位PCR技术 271

三、SISPA PCR技术 273

一、标本的倍比稀释法 274

第三节 HCV RNA定量PCR技术 274

二、竞争性逆转录PCR技术 275

三、放射性核素掺入法 276

四、HCV RNA定量检测的应用 277

第四节 PCR技术在乙肝病毒研究中的应用 278

一、检测微量HBV DNA 278

二、抗病毒疗效的评价 278

三、用于HBsAg亚型的研究 279

四、血液及血制品安全性的研究 279

五、鉴定HBsAg阴性的HBV感染者 280

一、基因治疗的策略 283

第一节 基因治疗概述 283

第十六章 抗肝炎病毒的基因治疗 283

二、基因治疗的条件 284

三、基因治疗的操作步骤 285

四、影响基因治疗的因素 286

五、病毒性肝炎基因治疗的整体构想 287

第二节 细胞内免疫抗病毒基因治疗 288

一、细胞因子转基因表达 288

二、抗病毒蛋白的转基因表达 290

三、病毒特异性抗体转基因表达 291

四、反式调节机制抗病毒基因治疗 291

五、反义技术抗病毒基因治疗 294

一、细胞自杀机制设计思路 295

第三节 细胞自杀机制的抗病毒基因治疗 295

二、病毒主导性酶药物预施疗法 296

三、白喉毒素的转基因表达 297

四、细胞程序化死亡机制 298

五、细胞自杀机制设计的应用 298

第十七章 抗肝炎病毒的反义技术 301

第一节 反义技术的概念 301

一、反义技术的定义 301

二、原核细胞中的反义分子 302

三、真核细胞中的反义分子 302

第二节 反义分子的种类和来源 304

一、反义分子的种类 304

二、反义分子的来源 308

第三节 反义技术的原理和应用 309

一、反义技术的原理 309

二、反义技术的应用 311

第四节 反义技术抗肝炎病毒的作用靶位 313

一、甲肝病毒基因组位点 313

二、乙肝病毒基因组位点 313

三、丙肝病毒基因组位点 314

四、丁肝病毒基因组位点 314

五、戊型肝炎病毒基因组位点 314

第十八章 抗肝炎病毒的寡核苷酸 317

二、修饰的ODN 318

一、n-ODN 318

第一节 寡聚核苷酸的种类 318

三、ODN与其它反应基团的结合 319

一、反义寡核苷酸的作用靶分子 319

第三节 反义寡核苷酸的作用机制 319

二、反义寡核苷酸的作用类型 321

第二节 反义寡核苷酸的药代动力学 323

一、一般原理 323

二、定量分析方法 324

三、体外资料 324

四、体内资料 325

第四节 寡核苷酸的合成 326

一、反义寡核苷酸人工合成的发展 326

五、药物毒性 326

二、核苷酸合成的策略 327

三、核酸小片段的化学合成 327

四、核酸小片段的酶促合成法 330

第十九章 抗肝炎病毒的核酶技术 332

第一节 核酶概述 332

一、核酶的发现 332

二、核酶的基本结构 333

三、核酶裂解反应条件 337

四、核酶催化的酶学性质 338

五、核酶RNA的来源 339

一、靶链的选择 340

第二节 核酶的分子设计 340

二、裂解位点 341

三、侧翼序列 342

四、活性中心化学修饰 343

五、载体序列 343

六、启示子序列 344

七、顺式和反式核酶 345

八、二级结构 345

第三节 抗肝炎病毒的应用 345

一、抗HAV RNA 核酶技术 346

二、抗HBV核酶技术 346

三、抗HDV核酶技术 347

索引 349